汪麟双 卫小蝶 邵玲俐 张俊英 张占军 李鹏博 孔令竹 徐晓宇 林东飞 卫东锋

(1中国中医科学院中医临床基础医学研究所,北京 100700;2首都医科大学附属北京佑安医院;3北京大学第三医院北方院区;北京师范大学 4认知神经科学与学习国家重点实验室;5老年脑健康研究中心;6重庆医科大学中医药学院;7中国中医科学院中医药信息研究所)

阿尔茨海默病(AD),又称老年性痴呆,是一种与衰老密切相关的神经退行性疾病,临床表现主要为渐进性的认知和记忆功能减退、定向不准确、判断能力丧失、语言表达能力丧失、缺乏逻辑判断能力、意识模糊、人格分裂和情感改变等认知功能慢性和持续性障碍〔1〕。目前全世界痴呆患者人数已高达5 000万以上,预计2050年将达到1.154亿人,其中50%～70%为AD患者。随着人口老龄化加剧,我国AD患者已超过1 000万〔2〕。目前AD发病机制主要包括以下几种假说,包括:①淀粉样蛋白-β(Aβ)级联假说,认为Aβ寡聚体导致突触损伤,神经元丢失;②Tau蛋白过度磷酸化异常集聚,产生神经元纤维缠结(NFT);③金属离子平衡紊乱假说,认为大脑中的金属离子转运蛋白异常表达导致钙、铁、铜、锌等金属离子在关键脑区分布异常,并引起氧化应激、细胞自噬等,进而损伤神经元胞体及轴突;④胆碱能假说;⑤能量代谢紊乱假说〔3〕。AD患者皮层金属离子代谢紊乱是导致认知功能障碍的重要原因之一。Roy等〔4〕研究表明,AD大脑组织中的金属离子与Aβ蛋白螯合聚集在老年斑核心及边缘。AD脑组织中金属离子代谢紊乱可导致神经元内质网应激、线粒体损伤、自噬功能障碍,这些病理又反向加剧金属离子分布不均及沉积,引起Aβ和Tau蛋白聚集,导致神经突触可塑性降低和神经元丢失〔5,6〕。

Mirza等〔7〕研究表明,家族性AD患者脑组织中的铝含量明显增多。队列元分析结果表明,AD患者脑组织、血清及脑脊液中的铝含量显著升高,提高铝的暴露程度使得AD风险增加71%。Aβ-铝耦合物可增加大量Aβ寡聚物的生成,并上调AD相关基因,如淀粉样前体蛋白(APLP)1和APLP2、微管相关蛋白Tau(MAPT)及β淀粉样前体蛋白(APP)〔8〕。当铜离子介导氧化还原反应时,也会产生一定的细胞毒性,可能导致神经变性〔9〕。目前,基因芯片微阵列技术和生物信息学分析已广泛应用于组学大数据深度挖掘和AD发病过程的机制研究〔10,11〕。本研究应用基因表达公共数据库(GEO)AD患者皮层中具有明显差异表达的基因数据,采用基因本体论GO分析和蛋白-蛋白相互作用(PPI)等方法进行生物信息学分析,深入探讨早期AD患者皮层中与金属离子代谢相关的差异基因分子功能和蛋白相互作用网络特征。

1 材料和方法

1.1材料 采集基因芯片数据,在GEO DataSets Advanced Search Builder搜索框中以“皮层和阿尔茨海默病”为检索词,获得GSE39420、GSE48350和GSE11882基因芯片数据。GSE39420为人类后扣带回区基因组RNA表达谱,采用商业化Affymetrix人类外显子1.1 ST芯片平台GPL11532进行检测,该芯片包含了7例AD患者和10例健康对照。GSE48350和GSE11882基因芯片数据为人类脑组织基因芯片数据,该数据采用商业化Affymetrix人类基因组U133 Plus2.0芯片平台GPL570检测,GSE48350芯片包含81例AD患者,GSE11882芯片包含63例健康对照。

1.2差异表达基因分析 将GSE39420、GSE48350及GSE11882芯片中共73例正常人作为对照组,88例AD患者作为模型组,应用GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)的R语言程序对3个基因芯片数据进行分析。AD组与对照组间差异基因的筛选标准为基因表达量变化倍数|FC|≥1.2且组间差异显著(P<0.05)。本研究选择其中的金属离子转运相关基因进行分析。

1.3差异基因表达蛋白的PPI调控网络分析 将30个差异基因表达的蛋白上传至STRING11.0 PPI-关系在线分析网站(http://www.string-db.org),通过调节可信度及附件节点参数,分析得到差异基因表达蛋白的PPI拓扑网络图谱及团簇生物功能分类网络图谱。进一步采用Cytoscape3.8.2软件及Cytohubba插件对调节金属蛋白酶水解和调节电压依赖性钙通道PPI子网络蛋白的度值进行分析,并筛选子网络中的关键节点蛋白。

1.4差异表达基因的基因本体GO富集分析

1.4.1差异表达基因的分类及分子功能分析 将30个差异基因上传至PANTHER16.0在线分类系统(http://www.pantherdb.org),通过调节数据种属类型及分析类型参数,调节结果展示图形类别,分别获得差异基因表达蛋白的分类结果和分子功能分类结果,进一步查看各分类中的详细基因名称及相关信息,对结果进行整理。

1.4.2差异表达基因的生物学过程及信号通路分析 在上述数据上传的基础上,进一步调节分析参数及结果展示类型,点击各生物学过程及信号通路分析结果,查看各生物学过程中所包含的所有基因名称及其详细信息,并查看每条信号通路中所涉及的基因数量、基因名称等相关信息。

1.5差异基因GO功能簇间的相互作用 将30个差异基因上传至Metascape在线基因注释与分析系统(https://metascape.Org/gp/index.html#/main/step1),对基因功能簇间相互作用进行分析,筛选差异基因富集度较高且相似度>0.3的基因功能簇构建相互作用网络,并筛选重要的基因功能簇。

2 结 果

2.1差异基因分析 如表1所示,通过组间基因表达分析,从AD患者皮层组织中筛选出30个与金属离子转运密切相关的差异基因,这些基因的表达均上调。

表1 AD患者皮层中与金属离子转运相关的30个差异表达基因

2.2差异基因表达蛋白的PPI拓扑网络及子网络蛋白度值 如图1所示,STRING蛋白相互作用在线分析结果表明,30个上调基因表达的蛋白之间存在相互作用关系,网络中预测的相关功能蛋白为甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶(MUT)、钙通道电压依赖性β1蛋白抗体(CACNB1)、钾离子通道相互作用蛋白(KCNIP)1、KCNIP2、电压门控性钾通道E亚家族,成员(KCNE)1、基质金属蛋白酶(MMP)3、MMP9、电压依赖性钙通道γ1亚基(CACNG1)、电压依赖性钙通道β2亚基(CACNB2)、MMP1、KCNE2、Discs同源物(DLG)4、N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基(GRIN)2B、GRIN2A、线粒体内膜移位酶亚基Tim(TIMM)13。如图2所示,团簇生物功能网络分析结果表明,PPI拓扑网络中包含3个不同生物功能的子网络,分别与调节金属蛋白酶水解(红色)、调节电压依赖性钙通道(蓝色)、介导跨膜蛋白进入线粒体内膜(绿色)相关。调节金属蛋白水解子网络中各节点蛋白的度值:电压门控钾离子通道亚家族D成员(KCND)2(度值10);KCNIP2、GRIN2B、GRIN2A、GRIN1、DLG4(度值7);电压门控性钾通道H亚家族成员(KCNH)2(度值6);KCND3、GRIN3A(度值5);KCNE1、KCNE2、KCNIP1、Disks大同源物关联蛋白(DLGAP)1、神经突触黏附样分子(LRFN)1(度值4);KCND1(度值3);TIMM8A、TIMM23、TIMM10Disks大同源物关联蛋白(度值2)。KCND2为该子网络的中心节点,度值为10,与子网络中的其他10个蛋白存在相互作用关系。GRIN1、KCNIP2、GRIN2B、GRIN2A及DLG4度值为7,为网络的关键节点,见图3。调节电压依赖性钙通道子网络中各节点蛋白的度值:电压依赖性钙离子通道蛋白亚基α(CACNA)1C(度值10);电压依赖性钙通道γ1亚基(CACNG)1、CACNB2、CACNB1、CACNA2D2、CACNA2D1、CACNA1D(度值6)。瞬时受体电位阳离子通亚家族M成员(TRPM)7、溶质载体家族6成员(SLC6A)8、压力型机械敏感性离子通站道组分(PIEZO)1(度值1)。CACNA1C为该子网络的中心节点,度值为7,与子网络中的其他7个蛋白存在相互作用关系,CACNB2,CACNA2D1、CACNA1D、CACNB1、CACNA2D2和CACNG1度值均为6,为网络的关键节点,见图3。删除这些关键节点,则网络结构涣散。这些子网络关键节点的基因表达量见表2,其中GRIN2B、GRIN1、CACNB2、DLG4的变化倍数较大。

2.3差异基因的GO分类 差异基因的GO分析结果包括基因表达蛋白的分类(蛋白总数30,分类匹配数目18)、分子功能(匹配数目24)、生物学过程(匹配数目30)及信号通路(匹配数目6)。

2.3.1差异基因表达蛋白的分类和分子功能分析 PANTHER系统蛋白分类结果表明,差异基因表达的蛋白可分为4个类别,包括基因特异性转录调节因子、蛋白结合活性调节因子、跨膜信号受体及转运蛋白,每种类别包含的基因及占总基因数量的百分比见表3。分子功能分析结果表明,差异基因的分子功能可分为4个类别,包括结合活性、催化活性、分子传导及转运活性,每种分子功能包含的基因及占总基因数量的百分比见表3。

图1 差异基因表达蛋白的PPI拓扑网络

图2 差异基因表达蛋白的相互作用团簇图

网络拓扑图中代表蛋白的圆形节点面积、颜色深度与其相关性度值呈正相关图3 子网络度值

表2 网络关键节点蛋白的基因表达信号值

2.3.2差异基因的生物学过程和信号通路分析 PANTHER系统生物学过程分类结果表明,差异基因的生物学过程可分生物调节过程、细胞过程、定位过程及代谢过程,每种生物学过程包含的基因及占总基因数量的百分比见表3。差异基因主要涉及肾上腺素和去甲肾上腺素的生物合成信号通路、α肾上腺素能受体信号通路、离子型谷氨酸受体信号通路、毒蕈碱型乙酰胆碱受体2和4信号通路及烟碱乙酰胆碱受体信号传导信号通路,每条信号通路包含的基因及占总基因数量的百分比见表3。

表3 差异基因表达蛋白的分类和分子功能及生物学过程和信号通路

2.4差异基因GO功能簇间的相互作用分析 如图4所示,Metascape在线分析系统富集得到差异基因功能簇之间的相互作用网络图,其中富集程度较高的GO基因功能簇包括无机阳离子跨膜转运、钠离子跨膜转运、钾离子跨膜转运、离子稳态、神经系统、阴离子转运、膜电位调节及溶质载体介导的跨膜转运。功能簇间的相互作用分析结果表明,神经元系统、膜电位调节、细胞离子稳态、小分子转运及细胞金属离子稳态与多个基因功能簇之间具有相互作用关系。

3 讨 论

研究表明,脑组织中金属离子稳态在维持脑的正常生理功能和认知功能方面具有非常重要的作用。部分细胞跨膜转运体、金属离子调节因子及金属离子伴侣蛋白能够保护和引导金属离子到达目的地〔12,13〕。脑内金属离子转运体异常可直接或间接地影响多种细胞途径,加重金属离子转运和沉积异常。AD患者脑组织中金属离子代谢紊乱是导致神经网络失连接和认知功能障碍的主要原因之一〔14,15〕。金属离子转运蛋白、传感因子及其伴侣蛋白表达异常可引起脑组织中金属离子代谢障碍,而金属离子失衡可加速Aβ沉积和磷酸化Tau蛋白聚集,导致NFT、神经元丢失、突触可塑性降低,进而导致AD的发生和发展。

AD患者脑内铁、铜、锌、钙等金属离子在不同脑区过量沉积,导致老年斑生成增多〔16,17〕。金属离子在大脑内错误沉积导致氧化应激,而离子失衡与氧化应激可通过激活β-或γ-分泌酶、抑制α-分泌酶,协同或独立地促进Aβ过量产生〔18,19〕。载脂蛋白(Apo)E4基因是AD的危险因素〔20〕,微量金属离子和一氧化氮含量异常会影响ApoE4基因的表达,导致AD患病率上升〔21,22〕。相关研究表明〔23,24〕,AD患者脑内多种铁代谢相关蛋白表达异常会导致脑内铁沉积,促使氧自由基生成,加重脑组织的氧化应激损伤。本研究中的皮层基因数据来源于AD患者皮层组织,筛选出的差异基因与皮层组织中金属离子代谢紊乱密切相关,包括电压依赖性钙离子通道亚基α2/δ1(CACNA2D1)、N-甲基-D-天冬氨酸离子能谷氨酸受体1、压力型机械敏感性离子通道组分1、瞬时受体电位阳离子通道亚家族M,成员7、溶质载体家族6,成员8、锌指蛋白318等。STRING分析结果表明,AD患者皮层中与离子转运相关的差异基因表达的蛋白之间存在相互作用关系,PPI网络中包含7个关键节点蛋白,分别为CACNA2D1、GRIN1、GRIN3A、电压门控钾离子通道亚家族D(KCND)3、电压门控钾离子通道亚家族(KCN)Q1及KCNQ5。

溶质载体基因表达的溶质载体转运蛋白是哺乳动物细胞膜蛋白的主要亚群之一,包括400多种跨膜溶质载体。这些膜蛋白利用H+与Na+梯度作为动力,将血液中的底物逆浓度梯度运输到脑细胞内部,满足大脑对能量和营养的较高需求〔25〕。本研究中筛选出12个溶质载体家族基因,占所有差异基因的25%。溶质载体转运蛋白在神经退行性疾病中起着重要作用,可调节神经递质γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸、5-羟色胺、多巴胺和去甲肾上腺素在突触区域的浓度〔26〕。其中,溶质载体家族(SLC)6也被称为神经递质转运体,可维持中枢神经系统中的抑制性神经递质GABA、甘氨酸与兴奋性神经递质谷氨酸之间的平衡〔27〕。

锌指蛋白(ZNF)家族是人类基因组中最大的转录因子家族,具有多种生物学功能。单倍型区块定量性状分析结果表明,ZNF827的单倍型区块与脑脊液中Aβ42的浓度相关。研究表明,ZNF突变体可对认知功能和神经影像学表型产生重要影响,如ZNF804A基因与额、颞叶灰质密度降低导致的认知障碍患者的认知功能损伤密切相关,能够影响神经突起生长、突触形成和多巴胺能传递相关基因的表达水平,在神经迁移、轴突生长和突触形成等过程中发挥重要作用〔28,29〕。本研究差异基因的生物信息学分析结果表明,AD患者皮层中的金属离子转运相关差异基因主要涉及结合活性、催化活性、分子传导及转运活性,通过调节α肾上腺素能受体、离子型谷氨酸受体、毒蕈碱型乙酰胆碱受体、烟碱乙酰胆碱受体信号传导信号通路参与生物调节、细胞过程、定位过程及代谢生物学过程,为早期AD研究提供了新思路和防治靶标。

综上,应用生物信息学和相关性分析方法对AD患者皮层组织中金属离子转运基因进行了深入分析,筛选出了7个重要调节基因,分别为CACNA2D1、GRIN1、GRIN3A、KCND3、KCNQ1和KCNQ5,以离子型谷氨酸受体信号通路为主,针对这些差异基因及其表达的蛋白进行深入研究,将有助于进一步揭示皮层金属离子转运基因在AD早期阶段的重要作用,并为AD的早期筛查和靶向治疗提供科学依据。