舒燕霞 郭江涛 徐文芬 张永萍,2,3 孙开芬 石兴雨 曾令琴

(1贵州中医药大学药学院,贵州 贵阳 550025;2国家苗药工程技术研究中心;3贵州中药炮制与制剂工程技术研究中心)

阿尔茨海默病(AD),又称老年痴呆,是一种中枢神经系统退变性疾病,其以广泛性大脑皮质萎缩引起的认知功能减退、行为及人格变化为特征,也是导致老年人死亡的4大疾病之一〔1～3〕。调查结果显示,全球约有5 000万人患有AD,我国目前有近600万的AD患者,65岁以上的老年人群中AD患病率高达3.21%,预计2040年将达到2 200万人〔4～6〕。各国学者虽开展其相关新药的研究,但大多以失败告终。目前被批准用于治疗的药物,只针对AD的某个单一致病靶点进行预防或治疗,虽在一定程度上改善患者症状,但不足以阻断或逆转其病理发展,且具有锥体外系症状、迟发型运动障碍等副作用〔7～10〕。

近年来,中药以其多组分、多靶点、协同效果及毒副作用小等特点,已引起学者的广泛关注。黑骨藤是贵州著名的十大苗药之一,系萝藦科杠柳属植物黑龙骨的干燥根或全株,有祛风除湿、舒筋活血、止痛之效,主治风湿关节痛、跌打损伤、骨折骨痛及各种神经性疼痛等症〔11～13〕。黑骨藤中含有黄酮类、甾体类、三萜类、蒽醌类等化学成分,具有抗类风湿、抗炎镇痛、抗氧化及神经修复等药理活性〔14～17〕,研究发现该药材的抗氧化和神经修复作用能有效降低神经退化性疾病AD的发生〔16,18,19〕,揭示黑骨藤在治疗AD方面具有很好的潜力,但目前关于黑骨藤治疗AD的活性成分和作用机制尚未明确。

网络药理学从多成分、多靶点及多通路的角度出发,揭示药物成分、靶点、疾病之间复杂的生物网络关系,分析、预测药物作用机制的研究方法〔20〕。分子对接技术则对于给定的蛋白质和配体,均可通过预测它们的结合模式及结合自由能,对其功能及作用机制进行研究〔21〕。因此,本研究采用网络药理学方法,从分子水平分析苗药黑骨藤的有效成分,预测其作用靶点及相关信号通路,并采用分子对接技术对其核心靶点与活性成分进行对接,初步探讨该药材治疗AD的作用机制,以期为黑骨藤治疗AD的药理研究和临床应用提供理论基础。

1 资料与方法

1.1苗药黑骨藤活性成分及靶点数据库的构建 通过中国知网(CNKI,https://www.cnki.net/)、万方(https://www.wanfangdata.com.cn/index.html)、PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库收集黑骨藤的化学成分。借助中药系统药理学数据库(TCMSP,http://tcm-spw.com/tcmsp.php),以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18及分子量(MW)<500为限定条件对所收集到的化学成分进行筛选;尚未在TCMSP中收录的成分则用Swiss ADME数据库,以胃肠道吸收(GI absorption)的设置为“High”、DL满足“Yes”为标准进行筛选,即可获取两个数据库整合的活性成分库。

在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中获取潜在活性成分的SMILES式,将SMILES式导入Swiss Target Prediction(http:swisstar-getprediction.ch/)数据库,以Probability>0为筛选条件,预测出与活性成分相关的作用靶点;在SEA Search Server(https://sea.bkslab.org/)数据库中,以人源基因为筛选标准获取Swiss Target Prediction中尚未收录的成分的相关靶点。整合Swiss Target Prediction、SEA Search Server数据库活性成分相关靶点信息,筛除重复靶点,建立黑骨藤潜在活性成分的作用靶点库。

1.2AD疾病靶点数据库的构建 利用GeneCards(https://genealacart.genecards.org/)数据库和OMIM(https://www.omim.org/)数据库,以“Alzheimer′s disease”“AD”“mild cognitive impairment”“MCI”“dementia”为关键词,进行人类基因检索。在GeneCards数据库中,由于疾病靶点数目庞大,则根据relevance score值进行中位数筛选,以获得更相关的靶点。合并两个数据库AD疾病靶点,删除重复项,建立AD疾病靶点库。

1.3药物-疾病交集靶点的获取 将黑骨藤活性成分靶点和AD疾病靶点导入Venny2.1.0(https:// bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)中,获得交集靶点的韦恩图,所得交集靶点即为黑骨藤活性成分可能作用于疾病的潜在靶点。

1.4“药物-成分-成分靶点”“成分-疾病-交集靶点”网络的构建 将1.1和1.3中的苗药黑骨藤活性成分及其对应靶点、成分与疾病的交集靶点分别建立网络文件,并编辑其属性文件。将两个文件导入Cytoscape3.8.0软件中,构建“药物-成分-成分靶点”和“成分-疾病-交集靶点”的可视化网络。网络图的节点分别为药物、疾病、成分、靶点,各节点之间的相互关系以边表示。

1.5蛋白互作(PPI)网络的构建及核心靶点的筛选 将1.3中得到的潜在作用靶点导入STRING数据库(https://string-db.org),选择“Multiple proteins”,设定物种条件为“Homo sapiens”,修改默认参数,选择中等置信度为“0.400”,即获得PPI网络关系图。在“Exports”中下载tsv.格式文件,将其导入Cytoscape3.8.0软件,根据degree值调节节点大小和颜色深浅,绘制PPI网络关系图。在PPI网络关系图中,以大于度值(degree)、中介性和紧密性的中位数为标准,且根据度值排序,筛选其核心靶点,绘制核心靶点网络关系图。

1.6基因本体(GO)富集分析和基因组百科全书(KEGG)信号通路分析 通过HIPLOT(https://hiplot.com.cn/advance)数据库,选择GO/KEGG富集分析模块,将1.3中的交集靶点导入数据表中,数据库选择“public/db/kegg/hsa_kegg_20210326.rds”、物种选择“org.Hs.eg.db”,特殊参数设置P<0.05、Q<0.05。利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)平台,将前10条功能注释目录和前20条信号通路目录,以柱状图和气泡图的形式可视化。其中,GO富集包括生物过程(BP),分子功能(MF)和细胞组分(CC)。

1.7“活性成分-核心靶点-信号通路”网络的构建 将1.6中KEGG分析的前20条信号通路所富集的靶点分别与1.1中苗药黑骨藤各活性成分的靶点进行交集,各交集靶点合并,删除重复项,建立网络文件,并编辑其属性文件。将两个文件导入Cytoscape3.8.0软件中,构建“活性成分-核心靶点-信号通路”的可视化网络。

1.8活性成分与核心靶点的分子对接验证 将黑骨藤的24个活性成分与PPI网络中排名前5(degree>75)的核心靶点进行分子对接。在Zinc(http://zinc.docking.org/substances/home/)、PubChem数据库获取配体活性成分3D结构的mol 2或sdf.格式文件;通过Open Babel3.1.1软件将小分子的sdf.格式转化为mol 2格式。同时在PDB(https://www.rcsb.org/)数据库中下载靶蛋白3D结构的pdb.格式,通过PyMOL2.4.1软件将蛋白质中水分子和多余的非活性配体移除,并将结果导入到AutoDock Tools1.5.6软件进行加氢、加电荷处理,输出为pdbqt.格式。在Grid模块设置对接搜索空间,通过Autodock vina运行分子对接过程,结合能Affinity<0表明受体和配体具有自发结合潜力,Affinity≤-5.0 kcal/mol说明化学成分与靶点对接效果较好〔22〕,最后利用PyMOL2.4.1软件将对接结果进行可视化处理。

2 结 果

2.1活性成分及靶点数据库的构建 将黑骨藤所含化学成分通过TCMSP数据库筛选出潜在活性成分15个,见表1;TCMSP数据库中未收载的成分,通过Swiss ADME数据库筛选得到9个活性成分:Periforgenin C(HGT15)、3β,5β-dihydroxy-14-en-card-20(22)-enolide(HGT16)、臭矢菜素A(HGT17)、臭矢菜素B(HGT18)、(-)-丁香树脂醇〔(-)-Syringaresinol,HGT19〕、(E)-1-(2,4-dihydroxy-phenyl)-Ethyl acrylate(HGT20)、邻苯二甲酸二丁酯(HGT21)、滇杠柳苷元A(HGT22)、(+)-1-羟基松脂酚(HGT24)。将两个数据库的活性成分合并,最终得到24个活性化合物。在Swiss Target Prediction数据库中,以Probability>0筛选得到各活性成分的作用靶点1 521个,并利用SEA Search Server数据库,以人源基因靶点为筛选标准获取Swiss Target Prediction中尚未收录的活性成分的相关靶点70个。对两个数据库所收集的活性成分靶点进行整合,并剔除重复靶点,共得到黑骨藤活性成分潜在作用靶点574个。

2.2AD疾病靶点与交集靶点的获取 通过GeneCards数据库和OMIM数据库获取AD疾病靶点,其中GeneCards数据库AD疾病靶点1 505个(relevance score≥13.15),OMIM数据库525个,所有靶点合并剔除重复值后,得到1 513个AD疾病靶点。将1 513个疾病靶点与574个药物靶点通过Venny 2.1.0网站在线分析,即可获得159个交集靶点。

2.3“药物-成分-靶点”“成分-疾病-交集靶点”网络的构建 选择黑骨藤的24个活性成分和106个潜在作用靶点(degree≥5)导入Cytoscape3.8.0构建“药物-成分-靶点”网络,并以degree值调节节点大小,该值越大则节点越大,见图1;图中共131个节点,740条边代表该药材化学成分与靶点之间的相互作用,活性成分节点越大,表明该成分所对应的靶点越多、靶点与成分之间的相互作用越强、成分越核心,体现了黑骨藤多成分、多靶点的特点。另将黑骨藤活性成分和交集靶点导入Cytoscape3.8.0构建“成分-疾病-交集靶点”网络,见图2;图中184个节点、519条边代表交集靶点与活性成分之间的作用关系。

表1 TCMSP数据库的黑骨藤活性成分信息

2.4PPI网络的构建及核心靶点的筛选 将159个交集靶点导入STRING数据库,设置中等置信度为“0.400”,获得蛋白相互作用关系,将其tsv.文件导入Cytoscape3.8.0软件绘制PPI网络,见图3;网络包含159个节点、1 981条边、平均节点度值为24.9,节点代表靶点,边代表蛋白间相互作用关系,线条越多表示关联度越大。根据degree值调节节点大小和颜色深浅,degree值越大则节点越大、颜色越深,依据网络拓扑学性质可知,有较多节点的化合物或疾病靶点在整个网络中可能起到核心作用。

在PPI网络关系图中,以大于degree、中介性和紧密性的中位数为标准,综合筛选得78个靶点,根据degree排序,选择前20个(degree>45)靶点作为核心靶点,包括丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)1、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)3、血管内皮生长因子(VEGF)A、类固醇受体辅助活化因子(SRC)、半胱氨酸蛋白酶(CASP)3等靶点,见表2、图4;网络包含20个节点、183条边,根据degree值调节节点大小和颜色深浅,degree值越大则节点越大、颜色越深,说明其参与生物功能越多,作用越强。

黄色“V”字形:AD;紫色菱形:活性成分;蓝色圆形:交集靶点图2 “成分-疾病-交集靶点”网络

图3 PPI网络关系

2.5GO富集分析和KEGG信号通路分析 将159个交集靶点导入HIPLOT数据库中,设置P<0.05、Q<0.05进行GO富集分析和KEGG信号通路分析。其中,GO富集分析得2 661条BP,涉及蛋白AKT活性的正调控、蛋白质的自磷酸化、神经细胞死亡等;587条MF条目,包括蛋白AKT活性、内肽酶活性、磷酸酶结合等;311条CC,涉及膜筏、膜微区、膜区等,根据基因数目排序,利用微生信平台绘制3个聚类分析的前10条功能目录的柱状图,见图5。柱状图越高,表示在该通路上所富集的靶点越多,该通路越重要。KEGG信号通路分析得218个条目,结果表明基因主要富集于AD、神经退行性疾病的途径-多发性疾病、炎症和免疫(如卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染)、癌症中的蛋白多糖、人类巨细胞病毒感染、内分泌阻力、神经营养素信号传导等相关通路。利用微生信绘制前20条信号通路的气泡图,见图6。图中横坐标代表基因比率,纵坐标代表通路;气泡越大表示在该通路上富集的基因数量越多,颜色越红表示P值越小、富集的显著性越高。

表2 PPI网络核心靶点的拓扑参数(前20)

图4 核心靶点(前20)

横坐标:基因比率;纵坐标:通路图5 苗药黑骨藤抗AD潜在靶点的GO富集分析

横坐标:基因比率;纵坐标:通路图6 苗药黑骨藤抗AD潜在靶点的KEGG信号通路

2.6“活性成分-核心靶点-信号通路”图的构建 利用Cytoscape3.8.0绘制“活性成分-核心靶点-信号通路”,根据degree值调节节点大小,degree值越大节点越大,说明其相互作用越强、对AD的影响越大,共有132个节点、720条边,由图7可知,苗药黑骨藤治疗AD是通过该药中的24个活性成分作用于20个主要通路和88个靶点基因的结果。

2.7分子对接验证 将24个活性化合物与5个核心靶点AKT1(PBD,ID:3OS5)、MAPK3(PBD,ID:6GES)、VEGFA(PBD,ID:6Z13)、SRC(PBD,ID:2PFH)、CASP3(PBD,ID:4QUJ)进行分子对接,最终得到120组受体-配体对接结果,见图8。

成分与靶点的结合能及形成氢键数量是评价分子对接结果的重要依据〔23〕。一般认为结合能Affinity<0,化合物与蛋白可自发结合,结合能越低、氢键数量越多,结合就越稳定,靶点与分子作用的可能性就越大。分子对接结果显示,120组受体-配体对接结合能Affinity均≤-5.0 kcal/mol,其中≤-9.0 kcal/mol的有33组,占27.5%,表明本研究中所预测的活性成分与关键靶点之间均具有较强的结合能力,证实了网络药理学预测结果的可靠性。将以上对接结果以PyMol2.4.1软件进行可视化,部分结果见图9。如图所示,活性成分山柰酚、槲皮素、汉黄芩素等与关键靶点SRC、MAPK3、VEGFA等结合能均≤-9.0 kcal/mol,且氢键数量均≥3,表明其结合构象较稳定、结合能力较强。

图9 “核心成分-核心靶点”对接结果

3 讨 论

本文采用网络药理学对苗药黑骨藤的主要活性成分、作用靶点、相关生物信号通路及其抗AD的作用机制等进行了探讨,并对其活性成分与相关核心靶点进行了分子对接。根据OB≥30%、DL≥0.18及符合类药性五原则筛选获得山柰酚、槲皮素、汉黄芩素、丹参酮ⅡA、杠柳苷元等24个潜在的活性成分。其中,槲皮素可提高体外培养神经元活性,改善氧化应激、炎症反应,抑制AD动物脑内毒性片段β-淀粉样蛋白(Aβ)1～42聚集、延缓Aβ的沉积速度,以改善AD大鼠记忆功能而达到治疗AD的目的〔24,25〕。山柰酚可通过调节炎症反应、改善胆碱能系统认知功能、抑制脑内Aβ的形成产生抗AD效应〔26～28〕。丹参酮ⅡA可通过抑制AD诱导的一氧化氮合酶(iNOS)及基质金属蛋白酶(MMP)-2蛋白的表达,减少氧化性毒害自由基的产生来缓解AD症状〔29〕。汉黄芩素可抑制小胶质细胞的迁移率、减少趋化因子单核细胞趋化因子(MCP)-1和正常T-细胞表达分泌因子(RANTES)的分泌减缓AD进程〔30〕。杠柳苷元是黑骨藤中具有抗增殖作用的成分,可通过改变死亡受体介导的细胞凋亡,特异性地杀伤脂肪肉瘤细胞,进而治疗AD〔31〕。

本研究共获得黑骨藤活性成分作用靶点与AD疾病靶点的交集靶点159个,这159个靶点可能是该药材抗AD潜在靶点。结合PPI网络与分子对接结果发现,AKT1、MAPK3、SRC、CASP3及VEGFA等核心靶点与黑骨藤活性成分具有较好的结合性能。相关研究表明,AKT1在神经系统发育中是一个用于神经细胞调节的关键调控因子,其氧化修饰作用可导致突触功能障碍,致使AD患者产生认知功能障碍〔32〕。MAPK能够参与调节神经细胞的整个生命过程,激活MAPK可使神经元中tau蛋白磷酸化水平增加;而抑制海马区MAPK表达可明显改善记忆、认知功能和突触可塑性,证明MAPK可能是治疗AD的一个潜在靶点〔33,34〕。SRC是生长因子受体信号通路中重要组成部分,而CASP3、VEGFA等均与细胞凋亡密切相关〔35,36〕。因此,以上靶点可能在苗药黑骨藤治疗AD中发挥重要作用。

本文结果提示,黑骨藤治疗AD呈现多成分、多靶点、多途径的作用特点。本文KEGG代谢通路富集结果显示,黑骨藤抗AD涉及的信号通路。排名最前的即为AD相关的信号通路,体现出苗药黑骨藤治疗AD具有较强的靶向性。炎症在AD的发病过程中起着至关重要的作用〔37〕,Aβ的聚集会引起小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,促炎细胞因子增多,激活的小胶质细胞,会产生更多的Aβ,进而导致额外的神经元损伤〔38〕。神经营养素信号传导通路通过连接多种细胞内信号转导调节,对于神经发育、学习记忆起着重要作用〔39〕。因此,结合分子对接和KEGG代谢通路富集分析结果发现,黑骨藤活性成分可能通过减少炎性因子分泌、激活神经营养蛋白信号通路、增加神经营养蛋白因子含量,发挥抗AD作用。

综上,预测苗药黑骨藤治疗AD的活性成分、靶点、信号通路及发现黑骨藤可能是通过抗炎、激活神经营养蛋白信号通路及增加神经营养蛋白因子含量等方面治疗AD,为黑骨藤抗AD药效物质基础及作用机制的深入研究奠定了研究基础,后续尚需进行体内外药效实验验证,为黑骨藤在临床治疗AD的应用提供理论支撑。