牛广旭,贾如江,宋晓明,郑神英,王朝辉

(1.邯郸市中心医院 病理科,056001; 2.邯郸市中心医院 普外一科,056001)

原发性肝癌以原发性肝细胞癌为主,多表现出肝区疼痛及乏力、消瘦、消化道症状等,但缺乏特异性表现,发现时多为中晚期[1]。原发性肝细胞癌的发病可能与饮酒、黄曲霉素、遗传、肝硬化或病毒性肝炎有关,手术为其常用治疗手段,但疗效不甚理想[2-3]。随分子肿瘤学研究的深入,探究疾病发生的分子机制可为肝细胞癌诊断及靶向治疗提供更多参考[4]。微染色体维持蛋白7(minichro-mosome maintenance protein7,MCM7)在甲状腺癌等癌症中表达较高[5],细胞分裂周期蛋白6(cell division cyclin 6,CDC6)则在结直肠癌中表达较高[6]。肝细胞癌基因通路复杂,为揭示MCM7、CDC6在其中的影响,本研究分别对原发性肝细胞癌患者癌组织及癌旁组织(与癌组织距离>5 cm)内MCM7、CDC6表达加以观察,分析这两项指标在原发性肝细胞癌诊断及预后预测中的应用价值,为原发性肝细胞癌的诊治及生存预测提供参考依据,现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年1月—2019年1月收治的68例原发性肝细胞癌患者,所有患者均行手术治疗。68例患者中男45例、女23例,年龄40～69岁、平均(55.13±2.88)岁,肿瘤直径<5 cm 20例、≥5 cm 48例,肿瘤淋巴结转移(tumor node metastasis,TNM)分期Ⅰ～Ⅱ期41例、Ⅲ～Ⅳ期27例,分化程度低分化39例、中高分化29例,乙肝表面抗原(hepatits B surface antigen,HBsAg)阳性52例、阴性16例,血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)<400 μg/L 24例、≥400 μg/L 44例,卫星结节35例。纳入标准:(1)患者入院后均诊断为原发性肝细胞癌[7],术后经病理学检查证实;(2)均行常规手术治疗;(3)均为首次诊治,且术前未接受过放化疗治疗;(4)病历资料完整;(5)患者均自愿参与本研究,并签署知情同意书。排除标准:(1)预计存活时间≤3个月;(2)围术期死亡;(3)随访失访;(4)合并其他恶性肿瘤;(5)重要脏器损伤;(6)合并急慢性感染。

1.2 研究方法

1.2.1MCM7及CDC6检测 68例患者根治性手术治疗后迅速多点取材,分别取癌组织、癌旁组织各2块,多聚甲醛固定、石蜡包埋处理,将标本切成3～4 μm厚切片后脱蜡至水,免疫组织化学染色方法(immunohistochemical sp method,SP)染色,以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)代替一抗作为阴性对照,MCM7抗体购自Neomarker公司,CDC6购自美国Abcam公司,SP试剂盒、DBA试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.2.2MCM7及CDC6判定标准 依据细胞染色程度与阳性细胞占比评分的乘积判定[8],阳性细胞染色程度:不着色记0分,淡黄色记1分,棕黄色记2分,棕褐色记3分。(1)MCM7阳性细胞比例评分为≥10%即记为阳性,计2分,<10%为阴性,计1分;染色阳性采用染色强度分数与阳性细胞比例分数的乘积[(染色程度评分+阳性细胞比例评分)/2]表示,>2分为阳性。(2)CDC6阳性细胞占比评分分别给予0分(<5%),1分(5%～25%),2分(26%～50%),3分(51%～75%),4分(>75%),两项评分之积≥3分为CDC6高表达,<3分为CDC6低表达。

1.3 观察指标

比较癌组织及癌旁组织中MCM7阳性检出率及CDC6高表达占比;分析不同临床病理特征的肝细胞癌患者MCM7阳性占比及CDC6高表达占比,并采取多因素logistics回归分析MCM7阳性、CDC6高表达的危险因素;3年院外随访,记录癌组织MCM7阳性及CDC6高表达患者术后3年存活率。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 癌组织及癌旁组织内MCM7阳性检出率及CDC6高表达占比

MCM7及CDC6阳性均主要定位于细胞质或细胞核(图1),癌组织内MCM7阳性检出率及CDC6高表达占比高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 癌组织及癌旁组织内MCM7阳性检出率及CDC6高表达占比[n(%)]

2.2 不同临床病理特征肝细胞癌患者MCM7阳性检出率及CDC6高表达占比

结果显示,不同性别、年龄及HBsAg阳性患者的MCM7阳性检出率及CDC6高表达占比差异无统计学意义(P>0.05);肿瘤直径≥5 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低分化、血清AFP≥400 μg/L、有卫星结节患者的MCM7阳性检出率及CDC6高表达占比较高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同临床病理特征肝细胞癌患者MCM7阳性检出率及CDC6高表达占比[n(%)]

2.3 MCM7阳性、CDC6高表达的多因素logistics回归分析

将临床病理特征存在差异的项目行量化赋值,肿瘤直径≥5 cm为1分,<5 cm为0分;TNM分期Ⅲ-Ⅳ期为1分,Ⅰ～Ⅱ期为0分;分化程度低分化为1分,中、高分化为0分;HBsAg阳性为1分,阴性为0分;血清AFP≥400 μg/L为1分,<400 μg/L为0分;有卫星结节为1分,无为0分。结果显示肿瘤直径≥5 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、HBsAg阳性、血清AFP≥400 μg/L、有卫星结节是MCM7阳性、CDC6高表达的危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 MCM7阳性、CDC6高表达的多因素logistics回归分析

2.4 癌组织MCM7阳性、CDC6高表达肝细胞癌患者术后3年存活率

68例行根治性手术的肝细胞癌患者均获得3年院外随访,3年死亡率38.24%(26/68),存活率61.76%(42/68);50例癌组织MCM7阳性患者中死亡率44.00%(22/50)、存活率56.00%(28/50),18例癌组织MCM7阴性患者中死亡率22.22%(4/18)、存活率83.05%(14/18),Kaplan-Meier生存分析显示癌组织MCM7阳性检出率越高患者存活率越低(Log-Rank=15.025,P<0.05);40例癌组织CDC6高表达患者中死亡率50.00%(20/40)、存活率50.00%(20/40),28例癌组织CDC6低表达患者中死亡率21.43%(6/28)、存活率78.57%(22/28),Kaplan-Meier生存分析显示癌组织CDC6表达越高患者存活率越低(Log-Rank=8.890,P<0.05)。

3 讨论

肝细胞癌及其他癌症的发病均与分子机制调控及基因有关,深入研究影响该病发生、发展的分子机制对提高疗效、改善预后有重要意义[9-10]。MCM为蛋白家族,其中MCM7复合物与真核细胞复制有关,MCM7在与DNA复制起始点结合后,染色质开始复制,且MCM7二聚体复合体具有解螺旋酶活性与ATP水解活性,可双链DNA解链[11-12]。王东星等[13]可证实MCM7对肝细胞癌的作用。细胞周期紊乱直接关系到肿瘤的发生,CDC6为ATP结合蛋白和复制前复合体一份子,具有ATP酶活性,多定位于人体17q21.3染色体[14-15],同样在起始DNA复制中有重要地位,还通过抑制CDK1蛋白活性而参与细胞的恶性转化,诱导肿瘤细胞增殖,连旭等[16]也佐证了这一点。癌细胞通过糖酵解获取能量,ATP则伴随糖酵解产生[17-19]。

本研究结果显示癌组织内MCM7阳性检出率及CDC6高表达占比高于癌旁组织,提示肝细胞癌患者癌组织内MCM7、CDC6呈现高表达。肿瘤直径、TNM分期、分化程度、血清AFP水平及卫星结节均为评估肝细胞癌病情及预后的参照。贾清馨等[20]发现肿瘤执行与肝细胞癌术后生存率直接关联;AFP被视为肝细胞癌的特异性血清标志物,如万波等[21]也发现肝癌复发患者血清AFP水平显著高于未复发组,且AFP高水平患者3年无瘤生存率显著较低,预后不佳;微血管侵犯与肝癌复发、转移关系密切,而卫星结节不仅与微血管侵犯检出率有关,更与肝癌总生存率有关,丁凌等[22]研究也针对这一点进行了论证。本研究显示肿瘤直径≥5 cm、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、分化程度低分化、血清AFP≥400 μg/L、有卫星结节患者的MCM7阳性检出率及CDC6高表达占比较高,并显示肿瘤直径≥5 cm、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、低分化、HBsAg阳性、血清AFP≥400、有卫星结节是MCM7阳性、CDC6高表达的危险因素,提示MCM7、CDC6不仅参与肝细胞癌的发病,还与病情进展有关,可能是肝细胞癌发展的关键靶点。牛广旭等[23]也表明MCM7阳性检出率会随病情严重程度加深而升高。

最后,通过对68例肝细胞癌患者3年院外随访结果的观察,发现肝细胞癌患者3年死亡率为38.24%,存活率为61.76%,50例癌组织MCM7阳性患者死亡率44.00%,存活率56.00%,18例癌组织MCM7阴性患者中死亡率22.22%,存活率83.05%;40例癌组织CDC6高表达患者中死亡率50.00%,存活率50.00%,Kaplan-Meier生存分析显示癌组织MCM7阳性检出率越高、CDC6表达越高患者存活率越低。提示癌组织MCM7阳性及CDC6高表达均会影响肝细胞癌患者生存质量。

综上所述,本研究发现原发性肝细胞癌患者癌组织内MCM7和CDC6与疾病的进展有关,且癌组织MCM7阳性及CDC6高表达均会影响肝细胞癌患者存活率。在肝细胞癌的后续诊断及治疗中,或可将MCM7及CDC6作为分子靶向治疗新思路,或根据患者MCM7及CDC6表达建立相应预后评估模型,对患者存活率加以预测[24-25]。本研究仅对MCM7及CDC6与肝细胞癌患者生存质量的独立影响加以观察,但能否将MCM7及CDC6联合应用进行肝细胞癌患者的预后预测尚不清楚,且对MCM7、CDC6与血清AFP的关系尚不明确,仍需多中心的深入研究。