唐银彤,官志忠,陆定艳,陈帅帅,吴忠秀,曹陶涛,郭玮钰,刘亭*

(1.贵州医科大学 药学院,贵州 贵阳 550004; 2.贵州医科大学 贵州省药物制剂重点实验室 &省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室,贵州 贵阳 550004; 3.贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室 &贵州省医学分子生物学重点实验室,贵州 贵阳 550001; 4.贵州医科大学 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心,贵州 贵阳 550004)

近年来,恶性肿瘤的发病率正逐步上升,国际癌症机构最新全球癌症数据也提示恶性肿瘤的预防及治疗至关重要[1-3]。治疗恶性肿瘤的方法包括放射、化学及手术治疗等,但都因具有严重的毒副作用而导致患者预后效果不理想,长期生存率也较低[4]。随着技术的发展,靶向治疗方案逐渐进入人们的视野[5],并被证明在恶性肿瘤治疗方面具有较好功效[6-7]。在表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)家族中,EGF受体突变体Ⅲ(EGF receptor variant Ⅲ,EGFRvⅢ)是常见的变异型[8],它是恶性肿瘤的特异性受体,仅在肿瘤细胞表面表达[9];约80%的恶性肿瘤患者过表达EGFRvⅢ基因,包括直肠癌、白血病、卵巢癌、胸腺癌、肺癌和胶质母细胞瘤等[10-15];EGFRvⅢ参与信号转导、转录等过程,其通常存在于扩增产物中,该类型的突变会导致大量的基因拷贝,从而促进细胞的生长信号转导和有丝分裂,最终加快恶性肿瘤的发展病程[16-18]。因此,针对EGFRvⅢ抗癌药物的开发成为治疗恶性肿瘤的热点之一[19]。黑骨藤(PeriplocaforrestiiSchltr)是滇杠柳的干燥根、全株,具有抗肿瘤、祛风除湿及通经活血等功效[20],系贵州“十大苗药”之一,当地居民常以水煎煮、酒剂服用,治疗风湿痛、擦伤及肿瘤等各种痹病,其提取物具有抗肿瘤活性。研究表明,黑骨藤的乙酸乙酯部位对肿瘤抑制率可高达97.48%,且对白血病的抑制率可达到80.71%[21]。高表达EGFRvⅢ的胶质母细胞瘤细胞系DKMG细胞(human glioblastoma cell line DKMG cells,DKMG)和不表达EGFRvⅢ的人脑星形胶质母细胞瘤细胞系U87MG细胞(U87MG)常用于恶性肿瘤的研究[22],本研究将利用DKMG细胞,探讨黑骨藤对其细胞存活率、凋亡率的影响,从信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)及蛋白层面验证EGFRvⅢ、BCL2-Associated X(Bax)蛋白质及B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表达情况,从而阐明黑骨藤杀伤DKMG细胞的作用及其机制,为其深入开发提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞来源 过表达EGFRvⅢ的人胶质母细胞瘤细胞株DKMG来源于江西阿普斯戴尔生物技术有限公司,不表达EGFRvⅢ的人脑星形胶质母细胞瘤细胞株U87MG由武汉普诺赛生命科技有限公司提供。

1.1.2主要药品与试剂 黑骨藤(贵阳万东桥),由贵州医科大学生药学教研室刘春花副教授鉴定;血清、Dulbecco's Modified Eagle Medium培养液(DMEM,美国Gibco),胰酶(美国Thermo),Eastep Super总RNA提取试剂盒、MTS细胞增殖与毒力检测试剂盒(MTS cell proliferation and cytotoxicity detection kit,MTS;北京Promega),凋亡试剂盒(美国BD),实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)所需TB Green qPCR Master Mix(北京Biomed),5×PrimeScript RT Master Mix逆转录试剂(日本TaKaRa),引物(上海英俊生物技术有限公司)。EGFRvⅢ引物上、下游分别为5′-GAGTACTGATCGCGAGAG-3′和5′-CTTCTGATAGCTGTCTGC-3′,Bcl-2上、下游分别为5′-ATGTGTCTGGAGAGCGTCA-3′和5′-CAGCCAGGAGAAATCAAACA-3′,Bax上、下游分别为5′-GGTTGTCGCCCTCTTCTACTT-3′和5′-GGAGGAAGTCCAATGTCCAG-3′,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上、下游分别为5′-CATCATCTCCGCCCCTTCTG-3′和5′-CATGGACCGTGGTCATGAGT-3′。磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)、甘氨酸(glycine,Gly)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、蛋白浓度测定试剂盒(BCA assay,BCA)及牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA;北京Solarbio),苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)和RIPA蛋白裂解液(RIPA lysis buffer,RIPA;大连美伦生物科技),BeyoECL Plus超敏ECL化学发光试剂盒(上海Beyotime),甲醇(国药集团),蛋白预染Maker(上海absin),聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF;德国Millipore),肌动蛋白(Actin,β-actin)、EGFRvⅢ、半胱氨酸蛋酶家族(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-3或Cleaved caspase-3)、Bax、Bcl-2一抗及山羊抗兔二抗(英国Abcam)。

1.1.3主要仪器 N50型核酸蛋白检测仪(德国IM-PLEN),BLOCOL层析柜(北京博医康实验仪器有限公司),Fresco型冷冻离心机和5%CO2培养箱(美国Thermo),690型酶标仪(上海伯乐),TS200型倒置显微镜(日本Nikon),流式细胞仪(美国BD),CFX型实时荧光定量PCR仪、Power Pac Basic型垂直电泳仪、Trans-Blot型蛋白快速湿转转印仪及GBOXChemiXL1.4型凝胶成像系统(美国Bio-rad)。

1.2 研究方法

1.2.1细胞培养 利用10% FBS及90% DMEM基本培养液培养DKMG、U87MG细胞,并置于5%CO2、37 ℃的培养箱中培养;取P4～P10代生长期且状态较好的细胞,进行扩大培养及实验。

1.2.2细胞分组及细胞毒性检测 取生长期的DKMG和U87MG细胞接种于96孔培养板中,细胞密度为2.0×108个/L,待细胞汇合度为80%时,弃旧培养基,分别将2种细胞设为空白(Control,Con)组、100 mg/L(低浓度)黑骨藤组、200 mg/L(中浓度)黑骨藤组及400 mg/L(高浓度)黑骨藤组,空白组加DMEM培养液,其余各组加黑骨藤,并使其终浓度为100、200及400 mg/L的培养液;各组药物作用细胞24 h,采用MTS检测各组的吸光度(absorbance,A)值,并计算各组细胞的存活率。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡率 取生长期的DKMG细胞接种于6孔板培养24 h,按“1.2.2”项下分组处理24 h,PBS洗涤细胞2次,按凋亡试剂盒避光染色15 min;利用流式细胞仪对样本进行检测,数据用FlowJo V10软件进行分析。

1.2.4qRT-PCR法检测DKMG细胞的GFRvⅢ、Bcl-2及Bax mRNA表达 将DKMG细胞按“1.2.3”项下分组给药处理24 h,按总RNA提取试剂盒操作流程,提取Con组及低、中、高浓度黑骨藤组DKMG细胞的总RNA。测定各组总RNA浓度,并反转录为互补DNA(complementary DNA,cDNA);qRT-PCR反应体系为2×Green qPCR Master Mix 10 μL、10 μmol/L上下游引物0.5 μL、cDNA 2 μL、加无核酸酶水至20 μL,95 ℃ 60 s预变性,95 ℃ 15 s变性、60 ℃ 30 s退火、72 ℃ 30 s延伸、循环45次,利用GAPDH管家基因进行归一化处理,并通过2-ΔΔCt法进行数据统计。

1.2.5蛋白免疫印迹法(Western blot)检测DKMG细胞的EGFRvⅢ、Bcl-2、Bax、Caspase-3及Cleaved caspase-3蛋白表达 取“1.2.3”项下分组给药处理24 h的各组DKMG细胞,加RIPA裂解液,提取Con组及低、中、高浓度黑骨藤组细胞的总蛋白,采用BCA试剂盒测定蛋白浓度,变性;取各组蛋白20 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳;恒压25 V转膜30 min,BSA封闭3 h,加一抗EGFRvⅢ、Bcl-2、Bax、Caspase-3及Cleaved caspase-3多克隆抗体(稀释度为1∶1 000);β-actin单克隆抗体(稀释度1∶2 000);4 ℃层析柜中孵育12 h,回收一抗,1×TBST洗膜5次、5 min/次,室温孵育二抗(稀释度1∶2 000)2 h;1×TBST洗膜5次,5 min/次;PVDF膜上均匀滴加ECL Plus超敏曝光液,显影,Quantity分析蛋白灰度值,以目的蛋白与管家基因β-actin的灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.3 数据统计分析

2 结果

2.1 细胞存活率

结果显示,与Con组比较,经低、中及高浓度黑骨藤组处理后的DKMG细胞存活率降低,且呈浓度依赖性(P<0.05);与Con组比较,低、中及高浓度黑骨藤组U87MG细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注：(1)与Con组比较,P<0.05;(2)与低浓度黑骨藤组比较,P<0.05;(3)与中浓度黑骨藤组比较,P<0.05。

2.2 DKMG细胞凋亡率

结果如图2所示,与Con组比较,低、中、高浓度黑骨藤组DKMG细胞凋亡率逐渐增加(P<0.05),且呈剂量依赖性改变。

2.3 EGFRvⅢ、Bcl-2及Bax mRNA的表达

结果如图3所示,与Con组比较,低、中及高浓度黑骨藤组DKMG细胞中EGFRvⅢ和Bcl-2 mRNA表达呈浓度依赖性降低(P<0.05或P<0.01),但Bax mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 EGFRvⅢ、Bax、Bcl-2、Caspase-3及Cleaved caspase-3蛋白的表达

蛋白表达实验结果表明(图4),中,与Con组比较,低、中及高浓度黑骨藤组DKMG细胞中EGFRvⅢ蛋白表达降低(P<0.05);中、高浓度黑骨藤组DKMG细胞中Bax蛋白和Bax/Bcl-2蛋白比值表达升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05);与Con组比较,低、中及高浓度黑骨藤组DKMG细胞中Cleaved caspase-3蛋白及Cleaved caspase-3/Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05),Caspase-3蛋白表达降低(P<0.05)。

注：A为各蛋白电泳结果,B为EGFRvⅢ蛋白表达,C为Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2蛋白表达,D为Caspase-3、Cleaved caspase-3及Cleaved caspase-3/Caspase-3蛋白表达;(1)与Con组比较,P<0.05;(2)与低浓度黑骨藤组比较,P<0.05;(3)与中浓度黑骨藤组比较,P<0.05。

3 讨论

EGFR家族中,EGFRvⅢ是最容易出现的突变型[23]。它是一种分子量为145 kDa的糖蛋白,由于缺乏胞外富含半胱氨酸的CR1和L1亚结构域,EGFRvⅢ不存在配体结合的区域,但能发生自体二聚体化而被激活[24]。作为组成型激活突变体,EGFRvⅢ会促进恶性肿瘤的发展,使其成为卵巢、乳腺及神经胶质等恶性肿瘤治疗的研究热点[25]。目前,靶向EGFR细胞外结构域的单克隆抗体及阻断受体细胞内磷酸化的小分子激酶抑制剂,已被临床批准上市,尽管两类EGFR抑制剂初始缓解率较高,但大多数患者最终会出现耐药[26-27]。因此,以EGFRvⅢ为靶标的药物逐步进入市场,且针对EGFRvⅢ靶点研制出嵌合抗原受体T细胞免疫、EGFRvⅢ抗体、EGFRvⅢ小分子抑制剂及EGFRvⅢ介导相关疫苗等多种治疗药物[28]。

研究表明,EGFR表达异常与恶性肿瘤细胞放射敏感性、转移、增殖、血管形成等密切相关,且与肿瘤发生、发展紧密关联,其中EGFRvⅢ对肿瘤的预后具有重要作用[29]。抑制EGFRvⅢ能够降低肿瘤细胞的增殖和致瘤性,从而促进肿瘤细胞的凋亡,这可能与EGFRvⅢ所激活的凋亡信号通路有关[30]。EGFRvⅢ被激活后,抑制凋亡蛋白Bcl-2表达上调,促使Bax二聚体解离,生成Bax/Bcl-2二聚体增多,从而抑制细胞凋亡[31]。为探讨黑骨藤对过表达EGFRvⅢ的DKMG细胞及不表达EGFRvⅢ的U87MG细胞的相互作用,本研究从细胞毒性等方面验证了其作用机制。本研究首先采用了MTS法测定细胞活性,研究黑骨藤对DKMG细胞及U87MG细胞活力的影响,结果显示低、中及高浓度黑骨藤可呈浓度依赖性杀伤DKMG细胞,但对U87MG细胞的毒性无影响;流式细胞术结果表明,各浓度黑骨藤能促进细胞凋亡,提示黑骨藤可能通过调控EGFRvⅢ对DKMG细胞产生细胞毒性,从而发挥治疗作用。

体内环境的动态平衡,一方面在于细胞的毒性作用,而另一方面在于细胞的凋亡过程[32]。在细胞的凋亡过程中常有多种蛋白酶及凋亡基因参与其中,从而促发了细胞凋亡信号通路,最终导致细胞凋亡[33];Caspase家族参与其中,活化的Caspase-3在凋亡级联反应中至关重要,其可降解DNA损伤修复酶,从而导致细胞凋亡[34];同等重要的Bcl-2蛋白家族中,凋亡信号调控与抑制细胞凋亡的Bcl-2、Bcl-XL蛋白及促进细胞凋亡的Bad、Bax蛋白等水平高低密切关联[35]。本研究qRT-PCR结果显示,与Con组比较,各浓度组黑骨藤可降低DKMG细胞中EGFRvⅢ和Bcl-2 mRNA表达,对Bax mRNA表达无影响;Western blot结果表明,与Con组比较,各浓度黑骨藤组可降低DKMG细胞中EGFRvⅢ、Bcl-2及Caspase-3蛋白表达,提高Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达。

综上所述,黑骨藤对高表达EGFRvⅢ的DKMG细胞具有细胞毒性,主要是通过降低EGFRvⅢ、Bcl-2及Caspase-3蛋白表达,上调Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达,从而促进细胞凋亡,进一步发挥抗肿瘤活性。