周琴,蒋红梅,孙广,张海龙,席敏,张云东*

(1.贵州医科大学 医学检验学院,贵州 贵阳 550025; 2.安顺市人民医院 检验科,贵州 安顺 561000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、全身性自身免疫性疾病,其主要特征是关节滑膜增生、炎性细胞募集、血管翳形成、软骨破坏和骨侵蚀等,最终导致关节畸形和功能丧失[1]。目前RA的诊断依据2010年美国风湿病协会(american college of rheumatology,ACR)和欧洲风湿病联盟(european league for rheumatism,EULAR)提出的RA评分系统和分类标准[2],存在一定的误诊和漏诊率,尤其对临床症状不典型的RA患者更为不利。白细胞介素-38(interleukin-38,IL-38)是IL家族中的一种受体拮抗剂细胞因子[3],有研究表明IL-38与炎症性自身免疫性疾病存在相关性,例如银屑病关节炎、系统性红斑狼疮及RA等[4]。T细胞受体CD3ζ链(cluster of differentiation 247,CD247)是T细胞表面受体-CD3复合物(T cell receptor-cluster of differentiation 3 complex,TCR-CD3)中的zeta链,参与TCR-CD3复合物的组装[5],对T细胞的激活起重要作用;CD247的表达已被证实与多种自身免疫性疾病相关[6],基因芯片筛选结果表明,CD247 mRNA与RA存在相关性[7-8]。有关RA患者外周血IL-38、CD247表达的相关研究较少,因此,本研究拟检测RA患者外周血中IL-38、CD247蛋白及CD247 mRNA表达,并与实验室特征进行相关性分析,评估IL-38、CD247在RA疾病中的诊断性能。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2021年12月—2022年5月就诊的RA患者56例,要求符合ACR和EULAR提出2010年RA评分系统和分类标准[9],排除伴有严重感染和恶性肿瘤疾病的患者、不能配合研究完成相关评分量表者及妊娠期妇女。同时收集其他风湿免疫性疾病[痛风8例、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)5例、骨关节炎(osteoarthritis,OA)3例、干燥综合征(sicca syndrome,SS)2例及系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)5例]患者23例作为非RA组和健康体检者12例作为健康对照(healthy control,HC)组。3组研究对象均知情同意,本研究已通过医院伦理委员会批准(〔2023〕安市医伦理专1号)。

1.2 研究方法

1.2.1一般临床资料 收集3组受检者年龄、性别、体质量指数(body mass index,BMI),记录RA组患者病程,检测RA组和HC组受检者C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)等实验室指标。

1.2.228个关节疾病活动性评分(disease activity score-28,DAS28)[10]评估RA疾病活动度 采用DAS28评分评估RA组患者治疗前的疾病活动度,评分越高表示病情越严重。根据DAS28评分将RA疾病活动度分为缓解期(DAS28<2.6)和活动期(2.6≤DAS28),其中活动期包括低(2.6≤DAS28<3.2)、中(3.2≤DAS28≤5.1)及高疾病活动度(DAS28>5.1)。

1.2.3酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清IL-38、CD247的表达 抽取HC组、RA组与非RA组治疗前及RA组患者治疗后空腹外周血4 mL,4 000 r/min离心10 min,分离血清备用;用ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)检测IL-38、CD247的表达。

1.2.4RT-qPCR法检测外周血单个核细胞(PBMC)中CD247 mRNA的表达 抽取RA组患者治疗前与HC组检测日的EDTA-K2抗凝空腹全血3 mL,用全血单个核细胞分离液(北京索莱宝公司)分离全血中的PBMC,置于EP管内,按照TriQuick总RNA提取试剂盒(北京索莱宝公司)提取PBMC中的RNA,标记后置于-80 ℃冰箱中备用;提前取上述RNA提取液恢复至室温,按照TaKaRa PrimeScript TM RT试剂盒(北京宝日医生物技术有限公司)纯化RNA,逆转录为cDNA;用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(TIi RNaseH Plus)试剂盒(北京宝日医生物技术有限公司)于罗氏4800扩增仪(上海罗氏诊断有限公司)上检测CD247 mRNA的相对表达,检测结果用2-ΔΔCt表示,引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般临床资料

RA组患者DAS28评分平均3.89±1.58分,病程为3.25(1.13,8.00)年。如表2所示,3组受检者性别比较,差异有统计学意义(P<0.05);3组受检者年龄、BMI比较,差异无统计学意义(P>0.05);RA组与HC组受检者CRP、ESR比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 RA组、对照组和非RA组被检者的一般资料

2.2 外周血IL-38、CD247蛋白及mRNA表达

如图1所示,RA组患者IL-38表达高于HC组、非RA组(P<0.05),RA组患者CD247蛋白表达低于HC组(P<0.05),与非RA组比较、差异无统计学意义(P>0.05);RA组患者CD247 mRNA表达低于HC组(P<0.05)。

注：(1)与HC组比较,P<0.05;(2)与RA组比较,P<0.05。

2.3 RA活动度程度与IL-38、CD247蛋白及mRNA表达

结果显示(图2),随着疾病活动度的升高,RA组患者IL-38表达逐渐升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与RA中低疾病活动度组、HC组及缓解RA组比较,RA高疾病活动度组患者外周血CD247蛋白和 mRNA表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。

注：(1)与HC组比较,P<0.05;(2)与RA低疾病活动度组比较,P<0.05;(3)与RA中疾病活动度组比较,P<0.05;(4)与RA高疾病活动度组比较,P<0.05。

2.4 IL-38、CD247蛋白及mRNA与RA患者疾病活动度、CRP及ESR的相关性

RA患者外周血IL-38 mRNA表达与疾病活动度程度呈正相关(r=0.716,P<0.001),CD247蛋白及mRNA与疾病活动度程度呈负相关(r=-0.512,P<0.001;r=-0.362,P=0.006);RA患者外周血IL-38 mRNA表达与CRP及ESR mRNA呈正相关(P<0.05),CD247 mRNA表达与CRP mRNA呈负相关(P<0.05)。见表3。

2.5 活动期 RA患者治疗前后外周血中IL-38及CD247蛋白表达

活动期RA患者治疗前外周血IL-38蛋白表达较治疗后下降(P<0.001),CD247蛋白表达较治疗后升高(P=0.007,表4)

表4 活动期RA患者治疗前后外周血IL-38和CD24蛋白的表达

2.6 IL-38、CD247蛋白及mRNA诊断RA的效能

ROC分析结果显示,RA患者IL-38、CD247蛋白及mRNA的ROC曲线下面积分别为0.841、0.702及0.758(P<0.05),IL-38诊断效能优于CD247蛋白及CD247 mRNA;联合检测分析显示,IL-38+CD247 mRNA联合诊断效能最佳,曲线下面积(AUC)为0.882,检测敏感性为66.1%,特异性为100%。见表5及图3。

注：A、B及C分别IL-38、CD247及CD247 mRNA单独诊断结果,D为IL-38、CD247蛋白及CD247 mRNA联合诊断结果。

表5 IL-38、CD247蛋白及CD247 mRNA对RA的诊断效能评价

3 讨论

RA是一种全身性自身免疫性疾病,除了导致关节畸形和功能丧失外,还会带来一系列的关节外的表现,包括类风湿结节、肺部血管受累以及全身合并症等[11]。研究表明,IL-38、CD247在RA患者中的表达异常[12-13],故本研究旨在验证RA患者外周血中IL-38、CD247的表达及其与临床特征、实验室指标的相关性,并评估其作为RA潜在生物诊断标志物的潜力。

有学者认为,由T淋巴细胞介导的炎症细胞浸润及其产生的炎症细胞因子是RA发病的中心环节[14],而T细胞功能的激活依赖其表面的T细胞受体(T cell receptor,TCR)-CD3复合物,CD247作为TCR-CD3复合体组装、表面表达和信号级联所必需的蛋白[15],很大可能参与了RA疾病的发生发展过程中。本研究结果表明,RA患者CD247、蛋白及mRNA的表达低于健康人群,并在低、中、高疾病活动度人群中呈现逐渐降低趋势。其可能机制为:RA中抗炎因子即Treg细胞可减少T细胞的激活,从而抑制CD247的表达水平有关[16]。进一步分析CD247与不同疾病活动度的相关性表明,CD247与RA疾病活动度呈负相关(r=-0.512,P<0.001),提示CD247可用于评估RA患者的病情严重程度。同时,治疗后CD247表达升高,缓解期RA患者表达可基本恢复至健康人群水平,表明CD247可用于评估治疗效果。

与CD247结果相反,本研究结果显示,IL-38在RA组外周血中的表达水平高于HC组及非RA组,在高活动期病人中呈现高表达,经治疗后降低,其表达增高可能为RA发生后刺激机体免疫系统产生的保护效应。多项研究表明,IL-38是一种抑制炎症的细胞因子,在RA中起到保护骨关节、抑制滑膜细胞增生的作用[17]。IL-38可能通过核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路抑制脂多糖/Toll样受体4(Lipopolysaccharide/Toll-like receptor 4,LPS/TLR4)诱导的炎症,减轻RA的炎症反应;还可通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen ativated protein kinase,MAPK)信号通路,减轻RA的炎症反应[18]。裴冰等[19]对RA试验动物模型胶原诱导关节炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠注射IL-38干预后,降低了辅助性T细胞17(T helper 17,Th17)细胞分泌的促炎因子量、升高了Treg细胞分泌的抗炎因子量,重新恢复Th17/Treg平衡,从而减轻RA疾病的发病与病情的恶化。然而,Mora等[20]也提出IL-38在高浓度条下会丧失抑炎作用,甚至发挥促炎因子的作用。本研究结果表明,RA患者经治疗后外周血中IL-38的表达水平较治疗前下降,缓解期RA患者IL-38的表达水平与健康对照组的表达无差异,表明IL-38可评估RA患者的治疗效果。此外,ROC曲线分析结果表明,单独诊断时,IL-38对RA具有较高的临床诊断价值;联合诊断时,IL-38联合CD247 mRNA检测对RA的诊断有一定的价值。

综上所述,本研究IL-38、CD247蛋白及CD247 mRNA参与到RA疾病的发生发展中,并且IL-38可能是RA疾病诊断的一个潜在生物诊断标志物。