黄 武,孟易禹,张丽娜

0 引言

鼻咽癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤,是我国南方最常见的肿瘤之一[1],具有位置深、侵袭性强、进展快、易复发的特点。鼻咽癌是一种放射敏感性肿瘤,放射治疗是其主要的治疗策略。尽管放疗可以提高鼻咽癌患者的5年生存率,但由于疾病位置较深,早期诊断困难,部分患者在治疗时已有淋巴结转移和远处转移,总体效果仍然较差[2-3]。因此,对鼻咽癌转移机制的探讨,寻找有价值的生物标志物和新的治疗靶点显得尤为重要。

miRNA是一种高度保守的非编码单链小RNA分子,约18～25个核苷酸,通过与靶基因的3′UTR序列结合,调控靶基因的表达。miR-155在包括鼻咽癌、乳腺癌在内的许多肿瘤组织中高表达[4-5],但是miR-155与鼻咽癌之间的关系及其分子机制尚未见报道。而ETS1(Eythroblastosis virus E26癌基因同源物1)作为一个转录因子,在鼻咽癌的进展和转移进程中发挥重要作用。本研究通过分析鼻咽癌细胞中miR-155和ETS1对侵袭转移的作用来探究其分子机制。

1 材料和方法

1.1 细胞系 人鼻咽癌细胞CNE1、CNE2、CNE2Z、HKP、5-8F和人正常鼻咽上皮细胞NP69购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

图1 miR-155和ETS1在鼻咽癌细胞中的表达

1.2 主要试剂 胎牛血清购自美国Hyclone公司;RPMI-1640液体培养基购自美国GIBCO公司;miR-155 mimics、miR-157 inhibitor和ETS1 siRNA均由吉玛基因公司设计合成;4%多聚甲醛购自上海博谷生物科技有限公司;青霉素-链霉素、胰蛋白酶消化液和结晶紫染色液购自上海碧云天科技有限公司;Matrigel基质胶(354234)购自美国BD公司;Fibronectin(F8180)购自北京索莱宝科技有限公司;Transwell小室购自美国corning公司;Lipofectamine 3000试剂盒购自美国赛默飞世尔科技公司;反转录试剂盒[miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop),MR101]和q-PCR试剂盒(miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix,MQ101-01)购自南京诺唯赞生物科技有限公司;兔单克隆抗体ETS1(14069S)、兔单克隆抗体MMP2(40994S)、兔单克隆抗体MMP9(13667S)和兔单克隆抗体GAPDH (2118)购自美国CST公司;HRP标记山羊抗兔IgG(A0208)购自上海碧云天科技有限公司;HRP化学发光底物购自美国Miliipore公司。

1.3 细胞培养和转染 人鼻咽癌细胞CNE1、CNE2、CNE2Z、HKP、5-8F以含10% FBS和1%青-链霉素的RPMI-1640培养基培养;人正常鼻咽上皮细胞NP69以含12% FBS和1%青-链霉素的RPMI-1640培养基培养;细胞正常培养环境为95% 空气、5% CO2、37 ℃、饱和湿度的培养箱。取对数生长期的CNE1细胞和5-8F细胞进行实验,转染时,按照说明书步骤[6],通过 Lipofectamine3000 转染miR-155 NC(5′-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGG GGU-3)、miR-155 inhibitor(5′-UCCCCTUTCUCGUTTUGCUTTUU-3′)、miR-155 mimics(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)和ETS1 siRNA(5′-GCA GAAAGAGGATGTGAAA-3′),以上4个质粒均购自广州市锐博生物科技有限公司。

1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-155和ETS1的mRNA表达 采用TRIZOL法提取人鼻咽癌细胞CNE1、CNE2、CNE2Z、HKP、5-8F和人正常鼻咽上皮细胞NP69中总RNA,按照说明书步骤建立16 μl反应体系,后行基因组DNA去除,并在上述体系中加入4 μl 的5×HiScript®Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ 混匀,并按50 ℃ 15 min和85 ℃ 5 s的程序进行逆转录。后利用StepOne Plus实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)将逆转录的cDNA用SYBR Green 法进行qPCR反应。采用2-△△CT法计算mRNA表达水平。引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司设计合成。miR-155:5-ACATTGATTATACGTGCTCGG-3 (forward),5-GCTCGGCCGAAGTTTAG-3(reverse);U6:5- CTCGCTTCGGCAGCACA-3(forward),5-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3(reverse);ETS1:5-TGCCCTGGGTAAAGAATG-3 (forward),5-GATACCGTAGCTGATGAAG-3 (reverse)。

1.5 蛋白印迹法测定ETS1、MMP2和MMP9蛋白表达 提取各组蛋白后,按照文献所述方法进行蛋白印迹法[7],其中抗体配比如下:ETS1(1∶1 000)、MMP2(1∶1 000)、MMP9(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)。

1.6 Transwell测定miR-155对人鼻咽癌CNE1和5-8F细胞的迁移作用 分别将150 μl无血清浓度为 2.0×106个/ml的转染miR-155 inhibitor、miR-155 NC的鼻咽癌CNE1细胞和转染miR-155 mimics、ETS1 siRNA和miR-155 NC的鼻咽癌5-8F细胞,加入Transwell上室;并在Transwell下室,加入含纤连蛋白和20%FBS的RPMI-1640培养基,培养24 h后取出Transwell小室,并拭去其上层鼻咽癌细胞后,加入甲醇固定15 min,结晶紫30 min染色后,洗去干燥。

1.7 Transwell测定miR-155对人鼻咽癌CNE1和5-8F细胞的侵袭作用 取预冷的无血清基质胶稀释液(Matrigel基质胶∶RPMI-1640培养基=1∶2) 50 μl,加入Transwell上室中,风干过夜后,其余步骤同“1.6”。

2 结果

2.1 miR-155和ETS1在鼻咽癌细胞和鼻咽上皮细胞中的表达 在鼻咽癌细胞CNE1、CNE2、CNE2Z、HKP、5-8F和人正常鼻咽上皮细胞NP69中,miR-155的表达量逐渐降低(P<0.05,见图1A),ETS1蛋白的表达量在鼻咽癌细胞CNE1、CNE2、CNE2Z、HKP、5-8F和人正常鼻咽上皮细胞NP69中也逐渐降低(P<0.05,见图1B)。在鼻咽癌细胞中,CNE1细胞的miR-155表达量和ETS1蛋白的表达量最高,5-8F细胞的两者表达量最低,因此,对鼻咽癌细胞CNE1和5-8F进行后续实验研究。

2.2 miR-155对鼻咽癌细胞CNE1和5-8F侵袭迁移的影响 分别将miR-155 inhibitor和miR-155 mimics转染至CNE1细胞和5-8F细胞(见图2A、2B),在CNE1细胞中,与miR-155 NC组相比,miR-155 inhibitor组的侵袭迁移能力明显下降[侵袭:(237.33±15.63) 个vs.(117.00±5.72)个;迁移:(331.00±9.42) 个vs.(262.00±11.05)个](P<0.05,见图2C、2D)。在5-8F细胞中,与miR-155 NC组相比,miR-155 mimics组的侵袭迁移能力显著提高[侵袭:(134.00±8.83)个vs. (326.00±12.68)个;迁移:(236.67±12.39个vs. (458.00±18.38)个](P<0.05,见图2E、2F)。

图2 miR-155对鼻咽癌细胞侵袭迁移的影响

2.3 miR-155 对 ETS1、MMP2、MMP9蛋白的影响 ETS1可以作为miR-155的下游调控基因。通过GEPIA数据库发现,在鼻咽癌组织中,ETS1表达量高于正常组织(P<0.05,图3A)。Western blot实验显示,在鼻咽癌CNE1细胞中,与miR-155 NC组相比,miR-155 inhibitor组ETS1、MMP2、MMP9蛋白表达减弱[ETS1:1.00vs. (0.77±0.04);MMP2:1.00vs. (0.58±0.05);MMP9:1.00 vs. (0.38±0.06)](P<0.05,图3B、3C);在鼻咽癌5-8F细胞中,与miR-155 NC组相比,miR-155 mimics组ETS1、MMP2、MMP9蛋白表达增强[ETS1:1.00vs. (1.61±0.06);MMP2:1.00vs. (2.63±0.06);MMP9:1.00vs. (3.38±0.06)](P<0.05,图3B、3D)。

图3 miR-155 对 ETS1、MMP2、MMP9蛋白的影响

2.4 miR-155通过ETS1促进鼻咽癌细胞的迁移和侵袭 转染ETS1 siRNA后,5-8F鼻咽癌细胞中ETS1的蛋白和mRNA表达水平均降低(P<0.05,图4A),miR-155 mimics+ ETS1 siRNA组的细胞迁移[(451.67±22.10) 个vs. (229.00±14.45)个]和侵袭[(402.33±8.22)个vs. (229.00±24.91)个]明显弱于miR-155 mimics组细胞(P<0.05,图4B),而ETS1、MMP2、MMP9蛋白的表达也弱于miR-155 mimics组[ETS1:(1.63±0.28)vs. (0.51±0.02);MMP2:(2.41±0.02)vs. (1.00±0.07);MMP9:(2.37±0.03)vs. (1.02±0.11)](P<0.05,图4C)。

图4 miR-155促进鼻咽癌5-8F细胞侵袭迁移的机制

3 讨论

鼻咽癌患者死亡的一个主要原因是发生转移[2-3]。在鼻咽癌侵袭转移过程中,细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)降解是重要步骤,肿瘤细胞只有通过降解ECM并侵入血管,随全身血液循环才能到达转移靶器官。基质金属蛋白酶(MMPs)是降解ECM最重要的蛋白水解酶,其中MMP2和MMP9在包括鼻咽癌在内的多种恶性肿瘤组织中高表达[8-9]。与慢性鼻咽炎组相比,鼻咽癌组织中MMP2及MMP9阳性表达率明显提高,与无淋巴结转移组相比,淋巴结转移组MMP2及MMP9阳性表达率显著升高,并且低分化鳞癌高于高分化鳞癌[10-11]。

ETS是在禽逆转录病毒E26的研究中发现的,其具有高度保守的DNA结合域,可以结合特定序列来调节靶基因的表达。ETS1是ETS转录因子家族的重要成员,通过与靶基因结合的顺式作用元件激活或抑制靶基因的转录,并对细胞生长、分化、凋亡、造血、组织重塑、血管生成等发挥作用[12-13]。已有研究证实,ETS1可以调节鼻咽癌的发展[14-15],体外下调ETS1的表达可显著抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭性[16]。

ETS1对下游靶基因转录的调节作用也受miRNA调节,本研究通过TargetScan网站(https://www.targetscan.org/)收集相关数据,结果显示,ETS1可以作为miR-155的下游靶基因,并在鼻咽癌组织和正常组织中差异表达。研究显示,miR-155在鼻咽癌中高表达,并且能够提高鼻咽癌细胞的增殖能力,抑制鼻咽癌细胞凋亡[17]。

本研究显示,miR-155能够促进鼻咽癌5-8F细胞的侵袭和迁移,并提高ETS1、MMP2、MMP9蛋白的表达;抑制miR-155能够降低鼻咽癌CNE1细胞的侵袭和迁移能力,并降低ETS1、MMP2、MMP9蛋白的表达。为进一步探索miR-155促进鼻咽癌细胞的迁移和侵袭转移的机制,本研究在5-8F鼻咽癌细胞中将ETS1蛋白干扰后,再次进行Transwell实验,发现干扰ETS1蛋白表达后,能够指抗miR-155 mimics增强肿瘤细胞迁移和侵袭的能力,并减弱MMP2、MMP9蛋白的表达量。

越来越多的研究表明,miRNA在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用[18-19]。部分对miRNA的研究已从实验室进入到临床阶段,目前有很多成功的Ⅰ期临床试验以及正在开展的Ⅱ期临床试验[20-22]。本研究发现,miR-155能够在体外促进鼻咽癌细胞的迁移与侵袭,其机制可能是通过调节转录因子ETS1促进细胞外基质降解过程而实现的,进一步揭示了鼻咽癌细胞侵袭和转移的发生发展机制,有利于对鼻咽癌疾病的认识,对于寻找鼻咽癌生物标志物和新的药物治疗靶点具有指导意义。