孙庆生,黄彭,李希,张姗,张照兰

1.郑州市中医院,河南 郑州 450000; 2.大连医科大学附属第一医院,辽宁 大连 116011;3.睢县人民医院,河南 睢县 476900; 4.潍坊市人民医院,山东 潍坊 261000; 5.虞城县人民医院,河南 虞城 476300; 6.河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州 450000

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是最常见的消化系统疾病,以黏膜萎缩、血管外露和黏膜结节为特征,临床主要表现为上腹痛、消化不良、腹胀、恶心、呕吐、打嗝、食欲不振和体质量减轻等。从病理学角度来讲,CAG可发展为肠化生和异型增生,而这些都属于癌前病变,也是从炎症到肠型胃癌的重要病理阶段[1]。数据显示,1%的慢性胃部炎症患者可能发展为恶性胃肿瘤[2]。目前CAG的西医治疗包括保护胃黏膜、抗幽门螺杆菌以及促进胃动力方面的药物。从中医学来讲,慢性萎缩性胃炎属于“痞满”“胃脘痛”等范畴,临床常见分型主要为脾胃虚弱证。六君子汤来源于《医学正传》,由人参、白术、茯苓、甘草、陈皮、半夏6味中药组成,具有益气健脾,燥湿化痰的功效,主要用于治疗食少便溏、胸脘痞闷、呕逆等脾胃气虚兼痰湿等脾胃气虚之证,临床研究表明,六君子汤可缓解脾胃虚弱型CAG患者的临床症状,减轻患者氧化应激及炎症反应[3]。

网络药理学是生物信息学的重要组成部分,在解析多组分药物作用方面发挥着重要的作用。李梢提出“网络靶点”这一新概念,将单个分子药物靶点的概念扩展到其对生物网络的系统效应,以研究化合物的系统性作用机制[4]。作为网络药理学的核心观点,“网络靶点”为分析研究中药方剂的物质基础及指导活性成分的挖掘提供新的研究策略。

CAG的本质是慢性炎症浸润[5],在生理病理过程中,核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小体以非活性形式出现,并被许多信号激活,在促进细胞炎症及程序性死亡中发挥重要作用[6]。目前,NLRP3炎性小体在慢性萎缩性胃炎中的研究缺乏,且在胃炎向胃癌转化机制中作用不明确。为了更好地研究NLRP3炎性小体介导的六君子汤治疗慢性萎缩性胃炎及其炎癌转化机制,本研究应用网络药理学进行分析,通过对六君子汤中目标化合物进行预测,将活性化学成分分别与活性靶点进行分子对接比较,同时,应用KEGG通路富集分析,进一步探究六君子汤对CAG的作用机制,并通过开源数据库分析平台对肠化生、异型增生、胃癌的不同病理阶段的核心靶点进行分析。

1 资料与方法

1.1 NLRP3相关靶点的预测以“NRLP3”为关键词,从以下数据库中获取NRLP3相关靶点:(1)比较毒理基因组学数据库(comparative toxicogenomics database,CTD,http://ctdbase.org/):用于研究化学物质、基因和疾病之间的作用关系;(2)STRING数据库:STRING作为在线分析平台,能够根据置信区间的不同,对不同蛋白质之间的功能联系进行预测;(3)STITCH数据库:STITCH数据库是一个用于检索已知的以及被预测的化合物和靶蛋白之间相互作用关系的开源数据库平台。

1.2 六君子汤化学成分筛选、靶点预测和NLRP3介导活性成分相关靶点的获取药物吸收、分布、代谢和排泄(absorption、distribution、metabolism、excretion,ADME)研究是药代动力学的重要内容,在药物筛选方面占有重要的地位。药物不仅具备较好的临床效果,还需要拥有最佳的ADME特性[7]。ADME参数的应用,不仅有利于降低新药研发的成本,而且有助于提高成功率。本研究基于药物ADME特性,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和类药性(drug-likeness,DL)作为筛选指标,设定OB≥30%且DL≥0.18[8],分别以“人参”“茯苓”“白术”“甘草”“半夏”“陈皮”为关键词,从中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[9]筛选六君子汤组方中药的活性成分。基于所筛选化学成分,通过以下2种方法预测成分相关靶点:(1)以活性成分为关键词,在TCMSP数据库中搜索相关靶点,选取来源于“DrugBank”的靶点以提高结果预测的准确性,其中DrugBank是生物信息学和化学信息学相结合的数据库,详细地将药物数据和药物靶标信息结合起来;(2)利用PubChem数据库检索成分的Canonical SMILES,并采用Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)[10]预测活性成分相关靶点。作为一个在线网络工具,Swiss Target Prediction基于相似原理,通过反向筛选预测小分子最可能的蛋白质靶标。根据其结果相关性,选取“probability>0.5”的靶点进行下一步分析[11]。使用Uniport数据库(https://www.uniprot.org/)[12]将成分所对应的蛋白名称转化为基因名,限定物种为“human”,从而获取成分相应靶点基因。将NLRP3相关活性靶点和活性成分靶点导入Cytoscape软件获取活性成分相关靶点和NLRP3相关靶点的交集,并构建“中药-活性成分-交集靶点-NLRP3”网络图,应用Network Analyzer功能对网络进行拓扑分析筛选核心活性成分。利用Cytoscape插件“Network Analyzer”功能对可视化网络进行拓扑学分析,获取自由度值(Degree)等相关参数以分析网络节点重要性。在网络图中,“节点”表示中药、活性成分、靶点或疾病,“边”是指两个节点之间的联系,节点的“度”是描述与节点相连的边的数目[13],度值越大,表明节点在网络中的重要性相对较高。

1.3 慢性萎缩性胃炎、炎癌转化重要病理阶段靶点预测和NLRP3介导的疾病相关靶点获取以“慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis)、肠上皮化生(intestinal metaplasia)、胃黏膜上皮异型增生(gastric epithelial dysplasia)、胃癌(gastric carcinoma/cancer)”为关键词,从以下数据库中获得疾病相关靶点:(1)DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/);(2)GeneCards数据库(https://www.genecards.org/),选择“Score>1”的靶点;(3)CTD数据库,选取经过验证的靶点;(4)药物靶标数据库(therapeutic target database,TTD,http://db.idrblab.net/ttd/)。通过Cytoscape3.2.1软件Merge功能取慢性萎缩性胃炎相关靶点和NLRP3相关靶点的交集,并构建“慢性萎缩性胃炎-NLRP3”网络图。

1.4 NLRP3介导六君子汤治疗慢性萎缩性胃炎潜在作用靶点的获取靶点通常作为网络中的成员发挥着整体协同作用,靶基因之间的相互作用关系在许多疾病的治疗中发挥着重要的作用。随着医学水平的高速发展,严重疾病的治疗正在从基因水平上得到解决[14],因此,了解蛋白之间相互作用关系,也有助于进一步研究其作用机制。将NLRP3介导的活性成分治疗慢性萎缩性胃炎靶点定义为潜在作用靶点,将“中药-活性成分-交集靶点-NLRP3”网络和“慢性萎缩性胃炎-NLRP3”网络相交,获取潜在靶点。为了获取蛋白之间相互关系,通过STRING数据库对潜在作用靶点进行分析,设定“Minimum Required Interaction Score ≥ 0.9”“Active Interaction Sources”来源于“Experiments”,获取潜在靶点相互作用网络,并利用Cytoscape将结果进行可视化,获得蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,通过网络拓扑分析进一步揭示网络中的关键靶点。

1.5 NLRP3介导的六君子汤治疗慢性萎缩性胃炎潜在作用靶点通路富集分析为了进一步阐明潜在作用靶点的作用机制,通过生物学信息注释数据库DAVID(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp,V6.8)对靶点进行京都基因与基因组百科全书 (Kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)通路富集分析,设定“Background”为“Homo sapiens”,以P<0.05作为显著功能和通路的临界值,并利用Cytoscape将“潜在靶点-通路”结果进行可视化分析。

1.6 分子对接通过对网络拓扑学分析之后,筛选出NLRP3介导的度值较高的靶点和相关活性成分,从RCSB蛋白质数据库(http://www.pdb.org/)下载候选靶点的晶体结构(http://www.pdb.org/),从PubChem数据库中下载化合物的SDF格式文件,通过SYBYL-X2.0软件进行去水、加氢和格式转换,执行分子对接,计算活性化合物和靶点的结合分数。为了更好地进行对比,同样选取阳性西药阿莫西林进行分子对接。

2 结果

2.1 NLRP3相关靶点以“NRLP3”为关键词,基于CTD、STRING和STITCH数据库检索相关靶点,去重后共计获得270靶点。靶点网络如图1。

2.2 六君子汤化学成分及相关靶点和NLRP3介导活性成分相关靶点基于OB≥30%且DL≥0.18的筛选标准,从TCMSP数据库得到六君子汤组方中药的152个活性成分。从TCMSP和Swiss Target Prediction预测得到181个成分相关靶点。通过Cytoscape3.2.1软件Merge功能取活性成分相关靶点和NLRP3相关靶点的交集,并构建“中药-活性成分-交集靶点-NLRP3”网络图,如图2所示,此网络包含127个节点(6个中药节点,107个活性成分节点,13个NLRP3介导的靶点)。应用Network Analyzer功能对网络进行拓扑分析发现,MOL000422(Kaempferol,山柰酚)和MOL004328(Naringenin,柚皮素)具有较高的Degree值,可能参与的生物功能较多,在网络中的重要性相对较强。

2.3 慢性萎缩性胃炎和NLRP3介导的疾病相关靶点从DisGeNET、GeneCards、CTD和TTD数据库获取慢性萎缩性胃炎相关靶点10 086个,通过Cytoscape3.2.1软件Merge功能取慢性萎缩性胃炎相关靶点和NLRP3相关靶点的交集,并构建“慢性萎缩性胃炎-NLRP3”网络图,如图3所示,此网络包含105个节点(1个疾病节点,NLRP3介导的疾病靶点103个)。

2.4 NLRP3介导的六君子汤治疗慢性萎缩性胃炎的潜在作用靶点将“中药-活性成分-交集靶点-NLRP3”网络和“慢性萎缩性胃炎-NLRP3”网络相交,获取11个潜在靶点。应用STRING数据库获取潜在靶点的PPI关系,设定“Minimum Required Interaction Score ≥ 0.9”“Active Interaction Sources”来源于“Experiments”,获取潜在靶点相互作用网络,并利用Cytoscape将结果进行可视化,如图4所示,PPI网络由45个节点(11个潜在靶点经STRING分析得到45个节点)构成,网络拓扑学分析显示,JUN、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARG)、蛋白激酶B1(protein kinase B1,AKT1)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)等靶点位于最内侧圈,具有较高的度值,可能在疾病治疗中发挥着重要的作用。

图4 NLRP3介导的六君子汤治疗慢性萎缩性胃炎潜在作用靶点PPI网络图

2.5 NLRP3介导的六君子汤治疗慢性萎缩性胃炎潜在作用靶点通路富集分析利用DAVID在线分析平台,45个靶点中共有36个核心靶点富集到23条通路中,利用Cytoscape构建“潜在靶点-通路”网络图,如图5所示,此网络包括60个节点,195条边,网络拓扑分析后,发现最内侧圈AKT1、丝裂原激活蛋白激酶10(mitogen activation protein kinase,MAPK10)、MAPK9、MAPK8、TNF和JUN等靶点具有较高的度值,MLRP3可能通过TNF和MAPK等信号通路发挥着重要的作用。

图5 “潜在靶点-通路”网络图

2.6 分子对接验证基于网络药理学分析结果,TNF信号通路富集的基因数目较多,且度值较高的靶基因均有显示,因此,NLRP3介导的TNF、AKT1、MAPK10、MAPK9、MAPK8、TNF和JUN等核心靶点群可能通过多种通路发挥治疗慢性萎缩性胃炎的作用。通过与Protein Lounge 数据库中的通路信息进行对比发现,TNF可能通过JUN、MAPK8、AKT1、CASP3、NLRP3发挥作用。将活性成分度值较高的山柰酚和TNF、JUN、MAPK8、AKT1,CASP3、NLRP3进行分子对接。同时,将抗幽门螺杆菌常用药物阿莫西林和上述靶点对接发现,诸多靶点和中药活性成分山柰酚、阳性药阿莫西林均具有结合作用,其中MAPK8的结合作用相对较强。见图6—图7。

图6 山柰酚、阿莫西林与TNF、JUN、MAPK8、AKT1、CASP3、NLRP3对接分值柱形图

图7 MAPK8 和山柰酚、阿莫西林分子对接示意图

2.7 NLRP3介导的六君子汤治疗慢性萎缩性胃炎及炎癌转化的作用机制分析将肠上皮化生、胃黏膜上皮异型增生、胃癌相应靶点和NLRP3介导的六君子汤治疗慢性萎缩性胃炎靶点相交,利用STRING平台获取各阶段交集靶点的蛋白相互作用网络图并将结果可视化。如图8所示,PPI网络图中可以看出,AKT1、TNF、JUN、CASP3等靶点均具有较高的度值,这也意味着治疗慢性萎缩性胃炎的各靶点在治疗肠上皮化生、异型增生、胃癌不同的病理过程中同样发挥着重要的作用。

图9 NLRP3介导的六君子汤治疗慢性萎缩性胃炎及炎癌转化的重要靶点机制

3 讨论

CAG的发生与幽门螺杆菌感染、饮食、遗传、药物等因素相关[15],在多种因素作用下,胃黏膜发生损伤,进而导致黏膜萎缩、肠上皮化生等病理改变[16],其临床主要表现为反复发作的非特异性消化不良,可将其归属于中医学的“痞满”“胃痛”“嘈杂”“吐酸”等范畴[17]。目前,CAG的治疗以西医对症治疗为主,缺乏特效药物,难以从根本上逆转其病理改变。研究表明,中医药不仅可改善CAG的临床症状,在修复胃黏膜、延缓甚至逆转CAG、抑制癌基因表达等方面也有显著疗效[18]。

中医学认为,CAG病位在胃,与脾、肾密切相关,其发生发展与外邪侵袭、饮食不节、情志失调、脾胃素虚等因素有关[19]。在多种因素影响下,脾胃虚弱,纳运失常,导致气血生化无源,气机升降失调,最终引起气滞、血瘀、痰湿等,进一步妨碍脾胃气机。CAG临床主要分为肝胃气滞证、肝胃郁热证、脾胃虚弱证、脾胃湿热证、胃阴不足证、胃络瘀血证等证型[20],但主要以脾胃虚弱证为基础,故临床多用益气健脾之法。作为益气健脾的中药方剂六君子汤,以人参为君药,具有补益元气,健脾益肺功效;白术、法半夏为臣药,具有健脾益气、燥湿化痰之功;茯苓、陈皮为佐药,能健脾和胃、理气健脾;甘草为使药,具有甘温益气兼有调和诸药的功效;诸药合用,共奏健脾益气和胃之效。

NLRP3炎性小体作为一种细胞质多蛋白复合物,能够对多种刺激产生反应,引起白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18等炎症因子的释放[21]。然而,在中药靶点数据库中未有NLRP3的收录。因此,本研究基于NLRP3炎性小体,从CTD、STRING和STITCH数据库预测得到相关靶点270个。通过TCMSP数据库,对六君子汤中的成分进行筛选并对其靶点进行预测,然后与NLRP3相关靶点取交集,拓扑分析结果显示山柰酚和柚皮素可能发挥着重要的治疗作用。从成分归属来讲,山柰酚和柚皮素归属于黄酮类化合物,均具有较好的抗炎作用[22-23]。

通过对NLRP3介导六君子汤治疗慢性萎缩性胃炎相关靶点分析发现,基于STRING平台实验数据来源获取潜在靶点的蛋白间相互作用关系,网络拓扑学分析显示,JUN、PPARG、AKT1和TNF等靶点可能在疾病的治疗中发挥着重要作用。KEGG通路富集分析结果表明,AKT1、MAPK10、MAPK9、MAPK8、TNF和JUN等为具有较高度值的靶点,可能通过TNF信号通路和MAPK等信号通路发挥着重要的治疗作用。研究表明,中医药能够通过抑制NLRP3的激活,调节PI3K/AKT信号通路,抑制炎症因子的聚集,发挥抗炎作用[24]。分子对接结果显示,诸多靶点和活性成分山柰酚、阳性药阿莫西林均具有结合作用,其中MAPK8的结合作用相对较强,表明中药单体成分山柰酚可能通过核心靶点MAPK8发挥重要的治疗作用。此外,通过炎癌转化相关靶点的对比发现,NLRP3介导六君子汤通过核心靶点群在肠上皮化生、异型增生、胃癌不同病理过程的治疗中发挥着举足轻重的作用。

幽门螺杆菌感染作为CAG的最常见的病因,随着病情的迁延进展,可以引起肠化生、异型增生甚至胃癌。在分子机制中,TNF/TNFR系统包括可溶性和跨膜形式的TNF,在慢性炎症的发病机制中发挥着重要作用[25]。TNF主要由内皮细胞产生,能够被细菌、炎症和其他刺激活化,在解除对TNF表达调控的动物模型中进行的广泛研究表明,TNF可能诱导炎症病理过程,同时发挥免疫调节作用[26]。AKT1是三种密切相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1、AKT2和AKT3)之一,称为AKT激酶,能够调节包括代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成在内的许多生理和病理过程[27]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶能够激活MAPK8/JNK1等MAPKs相关蛋白,参与细胞增殖、分化、迁移、转化和程序性细胞死亡等过程[28]。炎性小体是应对多种不同的外源性和内源性病原体信号的传导平台,NLRP3炎性小体是研究最广泛的炎性体之一,可调节IL-1β和IL-18等多种促炎细胞因子的成熟,驱动炎症相关级联反应,参与多种慢性炎症疾病[29]。因此推测,六君子汤可以根除幽门螺杆菌,进而可能阻断疾病发展。基于NLRP3相关靶点预测,应用中药化学和生物信息学相关理论,对六君子汤治疗慢性萎缩性胃炎的活性成分进行筛选并预测相关靶点,通过KEGG通路富集分析得到,AKT1、MAPK10、MAPK9、MAPK8、TNF和JUN等靶点可能通过TNF和MAPK等信号通路发挥重要的作用。作为临床常见病、多发病,慢性萎缩性胃炎常引起肠上皮化生、异型增生,并向胃癌发展,各病理阶段潜在靶点均和六君子汤治疗慢性萎缩性胃炎靶点在一定程度上重合,这也提示了六君子汤能够在“炎癌转化”的过程中发挥重要作用。因此,基于中医“治未病”的理论,六君子汤能够阻止慢性炎症向癌症的转化,这也为重要靶点的研究提供了思路。