汪辉,马丙祥,党伟利,张晰,周荣易

1.河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州 450000; 2.河南中医药大学儿科医学院,河南 郑州 450046

脑性瘫痪(cerebral palsy,CP)是以运动功能障碍为主的证候群,具有终身性、致残性的特点,是我国儿童肢体残疾的主要因素之一,可伴多种并发损害[1]。CP在世界范围内的发病率约为2‰,我国流行病学调查结果显示,CP儿童的发病率为2.46‰,男童患病率高于女童[2]。目前,我国尚有部分CP患儿不能得到早期发现和诊治,从而延误最佳干预治疗时机,给儿童及其家庭带来极大的痛苦和沉重的经济负担,也使社会承受沉重的负担[3]。因此,防治CP的发生已经成为小儿神经康复治疗的一项艰巨任务。

CP的病因有多样性及复杂性的特点,我国儿童CP主要致病因素为胚胎期间及新生儿期脑损伤[4]。宫内感染/炎症易引起新生儿早产出现脑损伤,甚至出现新生儿死亡,是新生儿重症之一。即使存活的患儿,多数伴有持续性神经功能损害,如CP、智力低下、癫痫等致残率很高的后遗症[5]。谷氨酸(glutamate,Glu)存在于中枢神经系统大约1/3的突触中,是神经突触中重要的神经递质[6],其介导的神经通路与宫内感染/炎症所致脑损伤相关性很高,Glu过量产生时,可造成神经系统损伤,即兴奋性毒性(excito-toxicity)。CP复杂的病理发展过程中,存在多种机制引起的一系列损伤级联反应,都以兴奋性毒性起始[7]。N-甲基-D-天门冬氨酸受体-2B(N-methyl-D-aspartate receptor-2B,NMDAR-2B)是Glu受体之一,激活后参与突触的可塑性。突触后致密物95(postsynaptie density-95,PSD-95)是位于突触后膜上的致密体蛋白,NMDAR是PSD复合蛋白的重要组成部分,二者共同作用于突触,对突触可塑性意义重大。

马丙祥教授创制了蒲金口服液(石菖蒲、郁金、丹参、红花),在儿童脑损伤等疾病的临床实践应用中效果显著。前期研究发现,蒲金口服液能减少缺氧缺血脑损伤新生大鼠脑组织中抗氧化自由基和一氧化氮合酶的水平,下调炎性细胞因子如白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平和髓鞘相关抑制因子(Nogo、OMgp)及其受体(NgR、P75NTR)的表达,促进神经的再生及功能修复,改善神经损伤的相关症状[8-11]。鉴于蒲金口服液在宫内感染/炎症致早产脑损伤中的保护作用,本研究观察蒲金口服液对脑损伤组织中PSD-95、NMDAR-2B表达的影响,以期阐明蒲金口服液作用于宫内感染/炎症致早产脑损伤的干预机制,为早期应用活血化瘀、化痰开窍中药治疗早产儿脑损伤提供理论支持。

1 材料

1.1 实验动物SPF级SD大鼠54只,雄雌比例为12,由武汉云克隆动物有限公司提供,动物合格证号:SCXK(鄂)2018-0021,实验在郑州科兴生物科技有限公司动物实验室进行。整个动物实验期间大鼠体质量控制在200～300 g,本实验经河南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会审批通过(伦理编号:YFYDW2018014)。

1.2 主要药物及试剂蒲金口服液由石菖蒲、郁金、丹参、红花组成,由河南中医药大学一附院制剂研究室提供,生产批号:20190622,其中低剂量组生药浓度为1.2 g·mL-1,高剂量组生药浓度为2.4 g·mL-1。银杏叶提取物(德国威玛舒培博士药厂,批号:7140315,配比浓度为3 g·L-1);脂多糖(美国Sigma公司,货号:SMB00704-5MG);Lipofectamine TM 2000(美国Invitrogen公司,货号:11668019);ECL化学发光试剂、蛋白质marker(美国Thermo Fisher Scientific公司,货号:34076、26616);Acrylamide、Bis-acrylamide、Tris-base、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine,TEMED)(美国Sigma公司,货号:A9099、A2792、TRIS-R0、11667289001、1.10732);吐温-20(Tween-20)、1 mol·L-1Tris-HCl(pH=6.8)、1.5 mol·L-1Tris-HCI (pH=8.8)(北京索莱宝科技有限公司,货号:T8220、T1020、T1010);PSD-95单克隆抗体、NMDAR-2B单克隆抗体(美国Santa Cruz公司,货号:sc-32290、sc-365597);HRP标记山羊抗鼠IgG二抗(美国CST,货号:96714)。

1.3 仪器SXP-1B型手术显微镜(上海医用光学仪器公司);PLM-1350型偏光学显微镜(上海光学仪器五厂有限公司);BZF-50型电热恒温干燥箱(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司);BCD-238E/X1型医用冰箱(中国容声公司);H1850R型台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);DK-8D型水浴锅(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司);SK-L180-S型摇床(北京大龙兴创实验仪器股份公司);DYCZ-24DN型电泳系统、DYCZ-40D型电转系统(北京六一生物科技有限公司);PT-3502C型多功能酶标仪(北京普天新桥技术有限公司);9700型Gene Amp PCR仪(美国Applied Biosystems公司);7500型实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 模型制备及分组将18只SPF级雄性大鼠与36只雌性大鼠以12比例于下午1700分组合笼共同饲养,每笼3只大鼠,次日上午0800将雌鼠与雄鼠分开饲养,棉棒用生理盐水湿润后取雌鼠阴道脱落细胞进行涂片观察,以观察到大量丝状精子细胞为标准并记为孕第0天,受孕后孕鼠另外饲养。随机将36只怀孕母鼠分为LPS组(n=30)和对照组(n=6)。参考李晓捷等[12]制作宫内感染动物模型方法,在母鼠孕期第16天及第17天,LPS组孕鼠腹腔注射350 μg·kg-1的LPS,对照组则注射相同剂量的生理盐水,然后记录孕鼠的分娩时间及新生仔鼠体质量,胎龄<22 d记为早产仔鼠。随机选LPS组早产仔鼠和对照组仔鼠各10只,进行HE染色以观察仔鼠脑组织病理学变化。将80只LPS组早产仔鼠按随机数字表法分为4组,每组20只,分别为高剂量蒲金口服液组、低剂量蒲金口服液组、银杏叶提取物组、模型组。随机选对照组正常分娩仔鼠20只,设为空白组。每组大鼠各随机选取10只,于仔鼠出生第0—7天进行早期药物干预,其余10只于仔鼠出生第7—14天进行晚期药物干预。

2.2 药物干预及标本采集仔鼠的灌胃剂量根据蒲金口服液临床用量进行折算,折算后低剂量蒲金口服液组仔鼠的给药剂量为12.5 g·kg-1,高剂量蒲金口服液组仔鼠的灌胃剂量为25 g·kg-1[13]。银杏叶提取物组仔鼠的灌胃剂量为3 mg·kg-1。模型组和空白组均给予同等剂量的生理盐水。早期药物干预组和晚期干预组均连续灌胃给药7天,灌胃体积10 mL·kg-1,给药后同等条件饲养至21日龄。仔鼠麻醉后断头取脑,剥离粗大血管,冷生理盐水多次冲洗,耳间线前2 mm水平处取一侧脑组织,于4 ℃体积分数4%多聚甲醛中固定72 h,切片备用,另一侧置于冻存管中,放入液氮罐内快速冻存,然后转移至-80 ℃冰箱中保存备用。

2.3 病理学观察随机选对照组和LPS组产后大鼠各4只,麻醉,切取子宫、胎盘,多聚甲醛固定,HE染色,光镜下观察以了解孕鼠宫内感染情况。同时随机选LPS组和对照组仔鼠各10只,断头取脑后组织固定,HE染色,观察新生仔鼠脑损伤状况。

2.4 RT-PCR检测PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA表达水平取20～40 mg组织加液氮研磨成粉末,加400 μL Buffer R-I,用注射器反复抽吸8～10次,转入1.5 mL离心管中,加200 μL Buffer R-II,涡旋振荡15～30 s,12 000×g离心5 min,取上清液至1.5 mL离心管中,每管加入250 μL异丙醇,混合均匀,并转移到制备管中,将制备管置于 2 mL 离心管中,6 000×g离心1 min,弃去滤液,加入500 μL Buffer W1A,在低温离心机中12 000×g离心1 min,加入700 μL Buffer W2,12 000×g离心1 min,离心两次后,将制备管放入干净的1.5 mL离心管中,在制备管膜中央加入30 μL Buffer TE,静置1 min后,12 000×g离心1 min,洗脱得RNA。将提取的RNA反转录为cDNA。反应体系如下:2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL,正、反引物各1 μL,待测DNA样本2 μL,加灭菌H2O补足至20 μL。qPCR反应条件:预变性:95 ℃反应30 s;循环反应:95 ℃反应20 s,60 ℃反应20 s,72 ℃反应30 s,共40个循环;溶解曲线:95 ℃反应20 s,60 ℃反应 50 s,95 ℃反应20 s。以GAPDH为内参,检测大鼠PSD-95、NMDAR-2B的mRNA水平。以2-ΔΔCt表示实验组和空白组靶基因表达之间的多重比率关系,并进行三次重复实验。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.5 Western Blot检测PSD-95、NMDAR-2B蛋白表达水平取脑组织按100 g·L-1的比例加入RIPA裂解液裂解30 min,离心取上清液即为蛋白样品。采用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量后,加入6×loading buffer,100 ℃变性10 min,配 SDS-PAGE胶,按照30 μg的量计算每个样品的上样体积进行上样,电压调至50 V进行电泳,待蛋白样品进入分离层后,调整电压为100 V继续电泳直至蛋白样品完全分离。根据待测蛋白分子量以及预染蛋白marker的指示,切下对应胶块,裁取合适大小的滤纸及NC膜,取电转夹按照“阳极-泡沫-滤纸-NC膜-胶块-滤纸-泡沫-阴极”的顺序铺好加紧后放入电转槽中,设定电流为300 mA,电转2 h。将湿转后的NC膜放在5%脱脂牛奶中,室温摇床封闭2 h。加入一抗(稀释比例11 000),4 ℃摇床孵育过夜。PBST清洗4次,每次5 min,加入二抗(稀释比例110 000),室温摇床孵育2 h。将NC膜从二抗中取出,室温摇床PBST洗涤4次,每次5 min。加ECL发光液,于暗室曝光5 min后,显影,定影,胶片保存扫描。使用Image Pro Plus 6.0软件扫描蛋白质条带并分析蛋白质相对表达量。

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况比较30只LPS组雌鼠中1只意外受孕,2只死亡,1只足月分娩(剔除),8只雌鼠流产,其余18只雌鼠均提前分娩,共产仔鼠176只,其中112只存活,64只死亡。对照组6只雌鼠均足月产仔,共产仔鼠57只,全部存活。与对照组比较,LPS组孕鼠的活产仔鼠数量显著降低(P<0.05),仔鼠出生时体质量显著降低(P<0.05)。LPS组仔鼠出生时皮肤暗红,部分出现暗紫色瘀斑或瘀点,主动活动少,对外界刺激反应弱,体质量较轻。见表2。

表2 各组孕鼠活产仔鼠情况比较

3.2 LPS对孕鼠子宫、胎盘和仔鼠脑组织的影响HE染色显示:LPS组孕鼠子宫壁充血,胎盘呈老化状态,绒毛间质纤维组织增生,毛细血管管腔变小,子宫和胎盘内可见炎性细胞浸润。而对照组孕鼠子宫、胎盘则未出现上述病理学改变。对照组仔鼠神经细胞排列整齐均匀,呈现圆形或椭圆形细胞核,核仁清晰,染色质较均匀;LPS组仔鼠脑室旁白质结构稀疏,神经元排列紊乱,出现明显的结构缺陷,少量细胞出现核固缩、溶解的现象。见图1。

注:A:LPS组孕鼠子宫;B:对照组孕鼠子宫:C:LPS组孕鼠胎盘;D:对照组孕鼠胎盘;E:LPS组仔鼠脑组织;F:对照组仔鼠脑组织;A-D,HE染色(×200);E-F,HE染色(×400)。图1 LPS对孕鼠子宫、胎盘和新生仔鼠脑组织的影响

3.3 各组大鼠PSD-95、NMDAR-2B蛋白表达水平比较不论在早期干预或晚期干预,与空白组比较,模型组PSD-95及NMDAR-2B蛋白相对表达量显著降低(P<0.05);与模型组比较,低、高剂量蒲金口服液组PSD-95、NMDAR-2B 蛋白相对表达量显著升高(P<0.05);与银杏叶提取物组比较,高剂量蒲金口服液组PSD-95、NMDAR-2B 蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。与同时期低剂量蒲金口服液组比较,高剂量蒲金口服液组PSD-95、NMDAR-2B 蛋白相对表达量显著升高(P<0.05);与晚期干预组比较,早期干预的低、高剂量蒲金口服液组和银杏叶提取物组PSD-95、NMDAR-2B 蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。以上结果表明,早期高剂量的蒲金口服液干预上调PSD-95及NMDAR-2B蛋白表达效果更显著。见表3、图2—图3。

注:A1:早期干预高剂量蒲金口服液组;B1:早期干预低剂量蒲金口服液组;C1:早期干预银杏叶提取物组;D1:早期干预模型组;E1:早期干预空白组。图2 早期干预组仔鼠脑组织PSD-95、NMDAR-2B蛋白表达条带图

注:A2:晚期干预高剂量蒲金口服液组;B2:晚期干预低剂量蒲金口服液组;C2:晚期干预银杏叶提取物组;D2:晚期干预模型组;E2:晚期干预空白组。图3 晚期干预组仔鼠脑组织PSD-95、NMDAR-2B蛋白表达条带图

表3 蒲金口服液对大鼠脑组织PSD95、NMDAR-2B蛋白表达水平的影响

3.4 各组仔鼠脑组织PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA表达水平比较不论在早期干预或晚期干预,与空白组比较,模型组PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA相对表达量显著降低(P<0.05);与模型组比较,低、高剂量蒲金口服液组PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA相对表达量显著升高(P<0.05);与银杏叶提取物组比较,高剂量蒲金口服液组PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。与同时期低剂量蒲金口服液组比较,高剂量蒲金口服液组PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA相对表达量显著升高(P<0.05);与晚期干预组比较,早期干预的低、高剂量蒲金口服液组和银杏叶提取物组PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。以上结果表明,早期高剂量的蒲金口服液干预上调PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA表达效果更显著。见表4。

表4 蒲金口服液对大鼠脑组织PSD95 mRNA、NMDAR-2B mRNA表达的影响

4 讨论

中医学认为,早产儿脑损伤的病位在脑,累及神志及四肢,且病况变化多样,临床治疗应以醒脑开窍、调理气血、疏通经络为治疗原则。早产儿脑损伤在中医学中无专有病名,目前普遍认同依据临床相关症状将其归于传统医学“五迟”“五软”“五硬”等范围,从病因学理解为孕妇“难产”和小儿“不啼”等。在中医古代相关文献中,“胎弱”“胎怯”等病症与脑损伤临床表现相符合。

《小儿卫生总微论方》针对早产儿出生窒息、不啼的病因进行具体分析,并提出了相应的处理方法和一些切实可行的、有针对性的防治方案。对于早产儿脑损伤的中医病因病机研究,目前尚无统一论断,临床多以相关症状反推病因病机,结合辨证,常见如先天不足,孕妇气血虚弱,精衰气弱,导致胎禀不良;胎妇嗜酒贪欲,亦或愤怒跌仆,胎形受损,导致胞损,筋骨不荣。父母暮年育之,或孕妇产多,成胎时元精浇漓,受胎则气血难养,导致生而怯弱。后天不足如幼小养护失当,饮食失调,或疾病缠绵不断,或受累于药害,或跌仆外伤,脏腑功能失司,气血损耗,百脉宗筋失于濡养而致病。

本研究中蒲金口服液由石菖蒲、郁金、丹参、红花四味药组成,具有化痰开窍、活血化瘀的功效。有研究发现,中药制剂丹参注射液能改善缺氧缺血脑损伤大鼠脑神经及突触结构的损害,提升突触素(synapsin,SYN)表达,改善突触超微结构[14-15]。现代研究证实,石菖蒲挥发油既能安神益智,又可开窍醒神,其有效成分具有显著控制脑损伤大鼠脑皮质神经细胞凋亡的效果,其水提醇沉液可使AlCl3所致痴呆大鼠的学习记忆能力提升,减少通过迷宫的时间,促进海马CA3区突触后膜致密物质增厚[16-17];郁金性寒,味辛、苦,归肝、心、肺经,其主要化学成分为挥发油和姜黄素,具有活血行气、凉血解郁、利胆退黄等功效,其中姜黄素还具有降血脂、抗氧化、抗炎、保护脑缺血再灌注和抗动脉粥样硬化等作用[18-20]。前期相关的实验研究结果显示,蒲金口服液能下调ROS产生、提升SOD活力、抗自由基,以实现扩脑膜血管、控制瘀血形成,有效改善脑损伤大鼠的缺氧缺血症状[8-11]。银杏叶提取物是目前临床应用最普遍的中药制剂之一,功效为活血通络化瘀,其主要成分为黄酮苷、银杏内酯和白果内酯等,具有显著的促神经突触生长、控制神经细胞凋亡、清除自由基、促脑血管扩张、抑制脑缺血再灌注损伤、抗炎等效果[21]。有动物实验表明,银杏叶提取物治疗新生缺血缺氧性脑损伤鼠有一定的疗效,所以本研究应用银杏叶提取物作为对照[22]。

宫内感染/炎症后,诱导tPA依赖性胶质细胞的激活,释放潜在的神经毒性物质和炎性因子,其中包括兴奋性氨基酸谷氨酸,谷氨酸释放增多,代谢减少,在突触间大量堆积,谷氨酸受体调控异常,突触后膜神经元过度兴奋,神经细胞因渗透性肿胀、变性、坏死而数量减少,轴突、树突发育不良,导致突触生成受阻和功能性修饰障碍,最终导致脑损伤,甚至CP。CP、中风及脑缺氧等疾病与谷氨酸受体介导的神经通路密切相关,谷氨酸受体介导的神经通路参与众多代谢活动,如神经元和神经胶质细胞的存活、发育、增殖及凋亡、突触可塑性变化等[23-24]。谷氨酸受体是中枢神经系统中极为重要的兴奋性神经递质受体,谷氨酸受体分为离子型和代谢型,而在中枢神经系统中突触前膜释放的谷氨酸主要与突触后膜的两种离子型谷氨酸受体结合从而发挥作用,即NMDAR和AMPAR[25]。NMDAR在突触后膜上常常与多种蛋白(黏附蛋白、骨架蛋白、衔接蛋白等等)共价结合形成复合物从而发挥其特定功能,所以当NMDAR与神经递质结合后,信号蛋白受到刺激进而激活下游信号通路,进而完成了NMDAR对突触可塑性的调节作用[26]。此外,突触可塑性亦可反向调节NMDAR的活性,当受到外界特定刺激后,神经元内NMDAR及相关蛋白(如PSD-95、eNOS、CaMKIIa等)表达增加,从而实现了二者间的双向调控。PSD-95主要通过两个PDZ结构与NMDAR的C末端相结合,参与NMDAR在突触上的富集、锚定以及胞内信号通路的激活,从而发挥其对突触可塑性的调节作用。因此,PSD-95对谷氨酸受体的成熟、神经元的发育以及突触可塑性的调节至关重要[27-32]。

本研究用RT-PCR、Western Blot法检验宫内感染/炎症造成早产脑损伤大鼠脑组织PSD-95、NMDAR-2B的表达,探讨蒲金口服液对宫内感染/炎症致早产脑损伤大鼠的作用机制,结果显示,与对照组比较,早产脑损伤大鼠脑组织内PSD-95、NMDAR-2B的mRNA和蛋白表达量下降,表明LPS感染引起的子代大鼠脑损伤与突触后致密物质密切相关。经过蒲金口服液治疗后,各组大鼠脑组织PSD-95、NMDAR-2B的mRNA、蛋白含量均提高,突触后膜致密物增多,且可能激活相关信号通路,促进神经元的增殖,抑制脑损伤的细胞凋亡,保证突触的结构完整性,有利于脑损伤细胞的恢复。早期高剂量蒲金口服液组的效果明显高于银杏叶提取物组与低剂量蒲金口服液组,表明早期高剂量蒲金口服液干预在促进神经细胞恢复方面作用显著,其机制与促进PSD-95、NMDAR-2B的表达,改善突触后膜致密物积聚与修复,调节突触可塑性,保持突触的结构完整性有关。

综上,高剂量蒲金口服液可上调宫内感染/炎症致早产脑损伤大鼠脑组织PSD-95及NMDAR-2B的表达,且早期干预效果更显著。神经细胞的再生、修复与重组机制比较复杂,本研究选取观察的时间点数量单一,无法完全明确宫内感染/炎症所致早产脑损伤仔鼠脑组织中PSD-95、NMDAR-2B表达水平的趋势。局限于突触后致密物PSD-95和NMDAR-2B两种靶因子,靶点单一,仍需进一步研究其他突触后致密物质和相关信号通道的影响及作用机制。