竹 萱,郭晶晶,谢文龙,肖 雪

(1. 成都中医药大学医学与生命科学学院,四川 成都 610072;2. 四川省医学科学院·四川省人民医院病理科,四川 成都 610072)

人类白细胞抗原(humall leukocyte antigen, HLA)-I类是一种在有核人类细胞上表达的膜结合蛋白复合体,在细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)介导的抗肿瘤免疫中起着非常重要的作用[1]。HLA-I类参与抗原递呈和CTL的激活,其在肿瘤细胞中的正常表达是CTL识别和杀伤肿瘤细胞的必要条件[1, 2]。HLA-I类在肿瘤细胞中表达缺失会减少肿瘤抗原的呈递,影响CTL的激活,从而导致免疫逃逸和免疫治疗耐药[2]。目前错配修复缺陷/高度微卫星不稳定(mismatch repair deficiency, MMRd/microsatellite instability-high, MSI-H)型肿瘤对免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor,ICI)具有较高的响应率[3, 4]。但是这些MMRd/MSI-H肿瘤也有可能因为HLA-I类的表达缺失对ICI不敏感。由于目前缺乏该分子在MMRd型肿瘤中表达情况的研究,故本文主要研究HLA-I类在MMRd型子宫内膜癌中的表达情况,其与CTL细胞浸润情况以及其它临床病理特征的关联。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集四川省人民医院病理科2017年1月至2021年3月的子宫内膜癌组织MMRd肿瘤样本90例。纳入标准:病理诊断子宫内膜癌,至少有一种MMR蛋白缺失,且具有足够的样本进行后续实验。排除标准:术前曾接受过针对肿瘤的治疗,或同时患有其它类型的肿瘤。所有石蜡包埋(FFPE)样本均再次进行切片和HE染色,并由两位病理医师复核诊断结果。随后根据MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表达情况,判定是否为MMRd肿瘤(见图1)。选取TCGA数据库中MSI-H子宫内膜癌患者147例,分析mRNA水平HLA-A、HLA-B以及HLA-C以及CD8A这四个基因的表达情况。

图1 1例代表性的子宫内膜癌MMRd肿瘤 (×200) a:肿瘤HE染色示例;b:MSH2表达正常(IHC染色);c:MLH1表达缺失(IHC染色);d:PMS2表达缺失(IHC染色)。

1.2 方法免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)染色 对每一例FFPE样本进行连续切片,随后在60 ℃下孵育1小时。经过二甲苯脱蜡,梯度酒精复水,抗原修复后,用3% H2O2进行阻断,然后对MLH1(克隆ES05)、MSH2(克隆RED2)、MSH6(克隆EP49)、PMS2(克隆EP51)、CD8(克隆SP16)以及HLA Class I ABC(克隆EMR8-5)进行染色。一抗4 ℃过夜孵育后,用二抗孵育30分钟,随后进行DAB显色(Dako REALTMEnVisionTM)。最后用苏木素染色并封片。由于通过IHC检测的MMRd结果和MSI-H的一致性高达90%以上,因此本研究未对样本进行MSI-H的检测[5]。

1.3 结果判读

1.3.1MMR状态的判读 MMRd定义为肿瘤细胞中任何一种MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)的核染色完全缺失,且存在阳性的内部对照(淋巴细胞、间质细胞或正常子宫内膜)[6]。肿瘤细胞中四种MMR蛋白均表达的肿瘤判定为错配修复正常(mismatch repair proficiency, MMRp)[6]。

1.3.2CTL密度的判定 CD8+TILs被判定为CTL。CTL的密度以浸润到肿瘤细胞区域的CD8+TILs的数量来评价。对于每个样本,从五个随机选择的高倍视野(High power field, HPF)中对CD8+TILs计数,再取平均值作为该样本的CD8+TILs密度[7]。

1.3.3HLA-I类表达状态的判读 HLA-I类正常(+)定义为>90%的肿瘤细胞具有该蛋白的膜和/或细胞质表达;HLA-I类部分缺失(±)定义为10%～90%的肿瘤细胞表达该蛋白;HLA-I类阴性(-)定义为<10%肿瘤细胞表达该蛋白。HLA-I(±)肿瘤和HLA-I(-)肿瘤均属于HLA-I缺失[8]。

1.4 TCGA数据验证HLA-I类和CD8+TILs浸润情况的关联从TCGA数据库中筛选出147例MSI-H子宫内膜癌,随后对组成HLA-I类的三个基因HLA-A、HLA-B以及HLA-C的mRNA表达丰度和CD8A 的mRNA表达丰度进行相关性分析。

1.5 统计学方法采用GraphPad Prism 9进行统计分析。正态分布数据用均值±标准差表示,非正态分布计量数据采用M(Q1,Q3)表示,采用Mann-WhitneyU检验。组间率的比较采用Chi-square或Fisher′s exact检验。Pearson相关分析用于衡量两组变量之间的线性关系。采用Kaplan-Meier法计算生存曲线,采用Log-rank检验确定其统计学意义。绘制ROC曲线图分析HLA-I类IHC染色对CTL密度的预测价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMRd肿瘤的临床病理特征90例MMRd肿瘤患者年龄(55.5±7.7)岁;其中子宫内膜样型86例(95.5%);低级别70例(77.7%);76例为早期(84.4%)。56例具有MLH1和PMS2表达缺失(62.2%),16例具有MSH2和MSH6表达缺失(17.8%),18例具有MSH6单独缺失(20%)。

2.2 不同临床病理参数中HLA-I类表达状态的比较90例MMRd肿瘤中,仅有48例(53.3%)HLA-I类表达正常(+)(图2a),30例(33.3%)为部分缺失(±)(图2b),12例(13.3%)为完全缺失(-)(图2c)。相比HLA-I类表达正常的肿瘤,HLA-I类缺失肿瘤中CD8+TILs的密度显著更低(P=0.0236)。不同组织学类型、肿瘤级别、肿瘤分期等其它临床病理特征之间,HLA-I类表达状态比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同临床病理参数中HLA-I类表达状态的比较

图2 子宫内膜癌MMRd肿瘤HLA-I类表达及CD8免疫组化染色示例 a:HLA-I类表达正常;b:HLA-I类部分缺失;c:HLA-I类完全缺失;d:肿瘤中的CD8+TILs (IHC染色,×200)

2.3 MMRd肿瘤中HLA-I类mRNA表达和CD8A mRNA表达的关系通过对TCGA数据库中147例MSI-H子宫内膜癌的分析,发现在mRNA水平HLA-A、HLA-B以及HLA-C基因的表达都和CD8A的表达呈正相关(r=0.4395;r=0.4543;r=0.3837,P<0.05)。见图3。

图3 mRNA水平HLA-I类表达和CD8A表达的相关性 a:HLA-A和CD8A呈正相关;b:HLA-B和CD8A呈正相关;c:HLA-C和CD8A呈正相关

2.4 MMRd肿瘤中HLA-I类表达对CD8+TILs密度的预测价值HLA-I类IHC染色状态曲线下面积为0.7613,对CD8+TILs密度具有较好的预测价值。见图4。

图4 HLA-I类表达免疫组化检测对CD8+TILs的浸润情况的预测价值ROC曲线

3 讨论

近年来ICI已成为子宫内膜癌患者的一种选择,MMRd/MSI-H也被FDA批准为筛选接受ICI治疗的患者的标志物[9]。其机理在于MMRd/MSI-H肿瘤会因为错配修复功能的缺陷导致肿瘤中累积大量的突变,继而产生很多新抗原,因此更容易被CTL识别和杀灭[4, 10]。然而临床数据显示大约一半的MMRd/MSI-H子宫内膜癌对ICI治疗并不敏感[11～13],提示还需考虑其它因素才能更有效地筛选对ICI敏感的患者。因此在MMRd/MSI-H的基础上,探寻补充性的标志物对提高ICI的治疗效果具有重要的意义。

ICI产生疗效的前提条件是CTL识别肿瘤细胞后发挥其杀伤肿瘤细胞的作用[2]。HLA-I类对肿瘤抗原呈递和CTL激活至关重要,该分子在肿瘤细胞的有效表达是CTL杀伤肿瘤细胞的必要条件[14]。因此,CTL的抗肿瘤效应会受到HLA-I类功能的影响。多种恶性肿瘤中都存在该分子的表达异常,从而限制CTL的激活和对肿瘤细胞的识别,导致免疫逃逸和对免疫治疗的抵抗[1, 14]。

Friedman等曾报道HLA-I类在子宫内膜癌中的缺失非常普遍[8],而本研究发现即便在肿瘤突变负荷很高的MMRd子宫内膜癌中,该分子的缺失比例也达到了近50%,提示该分子及其介导的抗原呈递通路失活在子宫内膜癌发生发展中起到重要作用。由于肿瘤中CD8+TILs密度和ICI的治疗敏感性高度相关,我们希望了解HLA-I类能否作为一种标志物来预测MMRd肿瘤中CD8+TILs的浸润情况,从而间接反应肿瘤对ICI治疗是否敏感。IHC结果显示HLA-I类的表达情况能较准确地预测CD8+TILs密度。

HLA-I类分子缺失可能由遗传、表观遗传、转录和转录后改变引起,从而导致其表达的不可逆或可逆变化[15～17]。不可逆的HLA-I类缺失往往由于关键基因的结构改变而产生,比如HLA-I类重链基因、β2M和TAP编码基因;而可逆性缺失往往和这些基因的转录或转录后下调有关[15, 18]。由于我们未对这些基因进行结构变异和转录分析,因此无法判断这些MMRd子宫内膜癌HLA-I类分子缺失的原因。近年来的研究显示针对可逆性的缺失,靶向HLA-I类抗原呈递的相关通路,特别是NF-κB,IFN和NLRC5,能逆转HLA-I类的表达[19～23]。因此,这些通路也成为了肿瘤免疫治疗的潜在靶点。

综上所述,由于该分子对肿瘤抗原向CTL的呈递至关重要,尽管MMRd/MSI-H肿瘤中具有大量的新抗原,HLA-I类缺失的肿瘤也很可能会因为抗原呈递的失败导致CTL无法激活并聚集到肿瘤细胞区域,从而对免疫治疗不响应。HLA-I类的IHC染色可能作为一种结合MMRd/MSI-H的补充性生物标志物,用于筛选ICI治疗候选患者,避免对该疗法不响应的患者使用这类药物。