王紫璇,倪 华,章 玉,杨立娜

(中国人民解放军西部战区总医院 a.肾脏风湿免疫科,b.消化内科,四川 成都 610000)

类风湿关节炎(RA)属于一种慢性自身免疫性疾病。据统计,我国RA发病率为0.3%～0.5%,且呈逐年递增趋势[1,2]。随着RA分子生物学及免疫学研究深入,马雪雯[3]指出,RA患者体内相关抗体可在出现关节肿痛、晨僵等临床症状之前存在于血液中,说明触发RA自身免疫的首发部位可能位于呼吸道、胃肠道等关节外的黏膜部位。其中肠道微生物群在维持机体免疫稳态及建立适应性免疫系统中具有重大意义,而肠黏膜屏障损伤与肠道菌群失调有着直接联系[4]。分泌型免疫球蛋白A(sIgA)是维持肠道黏膜稳态的主要物质,而外周血淋巴细胞亚群紊乱易造成免疫功能异常,促进RA的进展[5]。故本文旨在分析RA患者肠道黏膜屏障功能指标与sIgA的表达情况及其与外周血淋巴细胞亚群的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料2019年9月至2022年5月我院收治的126例RA患者(RA组)。纳入标准:①符合《2018中国RA诊疗指南》[6]的诊断标准,并经CT、MRI等检查确诊;②病历资料完整;③患者关节压痛数量在5个以上、关节肿胀数量在3个以上;④患者均知情同意;⑤患者入院时处于疾病活动时期且均未接受系统治疗。排除标准:①其他类型骨关节炎及结缔组织病;②合并乙型肝炎、肺炎等感染性疾病;③存在骨肿瘤、胃癌等恶性肿瘤或存在严重胃肠道疾病。其中男37例,女89例,年龄58～72岁[(65.34±3.28)岁],病程2月至11年[(5.08±2.15)年],红细胞沉降率(56.39±19.27)mm/h;DAS-28评分(4.82±1.61)分;IgG水平(13.69±3.52)g/L;IgM水平(1.31±0.62)g/L;IgA水平(3.43±1.39)g/L;C3(1.09±0.35)g/L;C4水平[0.2(0.1,0.3)]g/L;RF滴度[111(30,433)]U/ml。选取同期体检的健康志愿者81例为对照组,男23例,女58例,年龄57～73岁[(66.07±3.86)岁]。两组性别、年龄等基线资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过医院伦理委员会审批。

1.2 方法①资料收集:由专业医务人员在患者入院时,详细记录患者年龄、性别、家族史、吸烟饮酒史、合并症及各项生化指标结果等临床资料,并统一纳入研究系统进行比较。②肠屏障功能评估:抽取受检者空腹静脉血3～4 ml,随后进行离心处理(10 min,3000 r/min),分离血清后将其置于-80 ℃低温保存待检。使用DAO/D-乳酸/细菌内毒素联检试剂盒(酶法)定量测定血清DAO、细菌内毒素及D-乳酸水平。②sIgA水平检测:患者在采样前均无腹泻、呕吐史,取粪便称重,加入生理盐水,将其稀释为1∶3。随后进行离心处理(2000 r/min,10 min),取上层清液置于-80 ℃低温保存待检,采用ELISA法检测sIgA水平。③外周血淋巴细胞亚群检测:抽取受检者肘静脉血5 ml,使用流式细胞仪(Calibur,美国BD公司)进行检测。

1.3 观察指标①比较两组肠道黏膜屏障功能相关指标及sIgA水平,包括DAO、血细菌内毒素及血D-乳酸。②比较两组外周血淋巴细胞亚群变化情况。③分析T淋巴细胞亚群与DAO、D-乳酸、内毒素及sIgA的关系。

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0软件分析数据。符合正态分布的计量资料以均数±标准差描述,组间比较采用独立样本t检验;不符合正态分布的计量资料以M(Q1,Q3)表示,组间比较采用非参数检验。计数资料以例数(%)表示,组间比较采用χ2检验;相关性检验采用Pearson线性相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肠道黏膜屏障功能相关指标及sIgA水平比较RA组DAO、细菌内毒素、D-乳酸水平高于对照组,sIgA水平低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组肠道黏膜屏障功能相关指标及sIgA水平比较

2.2 两组外周血淋巴细胞亚群变化情况比较RA组总T淋巴细胞CD3+、辅助/诱导T淋巴细胞CD4+、抑制/杀伤T淋巴细胞CD8+及NK淋巴细胞CD16+CD56+绝对计数低于健康对照组(P<0.05),两组B淋巴细胞CD19+绝对计数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组外周血淋巴细胞亚群绝对计数比较 (cell/μl)

2.3 外周血淋巴细胞亚群与DAO、D-乳酸、细菌内毒素及sIgA的相关性分析辅助/诱导T淋巴细胞CD4+绝对计数与血清DAO、细菌内毒素、D-乳酸水平呈负相关,与sIgA呈正相关(P<0.05);B淋巴细胞CD19+绝对计数与sIgA呈负相关(P<0.05)。见表3。

表3 外周血淋巴细胞亚群与DAO、D-乳酸、内毒素及sIgA的相关性分析

3 讨论

RA是以B淋巴细胞功能亢进和T淋巴细胞机能显著下降为特征的自身免疫性疾病,具体的发病机制尚未完全明确。但以往多项研究显示,RA患者存在较为严重的细胞免疫异常,RA的发生与外周血淋巴细胞亚群的数量及功能紊乱存在联系[7,8]。故密切监测外周血淋巴细胞亚群的变化情况在RA的临床诊断及早期治疗中具有重要意义。

2012年美国风湿病学会提出,将RA相关环境及遗传风险因素阶段、无临床关节炎症状阶段及RA相关系统性自身免疫阶段总称为RA临床前期[9]。Greenblatt[10]报道,部分患者在RA临床前期未发生自身免疫性组织损伤的条件下已出现自身抗体水平异常等情况,在环境、遗传等多种因素的共同作用下启动自身免疫反应,造成免疫性组织损伤。且多种基因测序技术证实,RA的始动源于机体黏膜系统,发现部分RA患者肠道乳酸菌丰度增加、嗜血杆菌减少,且上述改变与自身抗体滴度和疾病的活动度相关,提示肠道菌群紊乱可出现于RA临床症状之前[11,12]。胡丹[13]的动物实验研究结果显示,RA临床前期人群的肠道菌群使得小鼠肠道黏膜屏障损伤,导致相关菌群穿透黏膜发生移位,造成全身免疫系统失衡。因此,本文主要分析RA患者肠道黏膜屏障功能指标与sIgA的表达情况及二者与外周血淋巴细胞亚群的关系,旨在为RA的临床诊疗提供新思路。DAO、D-乳酸及细菌内毒素等实验室检查指标常用于评估肠黏膜屏障受损情况,而sIgA主要位于肠系膜淋巴结等黏膜下相关组织中,其属于黏膜免疫系统的重要抗体,在复杂的肠道内环境中发挥保护作用;若sIgA选择性不足可造成循环免疫复合物水平的升高,从而增加消化系统感染性疾病的发生风险[14]。本研究结果显示,RA组DAO、细菌内毒素、D-乳酸水平高于对照组。陈昌明等[15,16]研究表明,部分早期RA患者均存在亚临床肠道炎症,主要以T、B细胞及浸润性单核细胞、CD68+巨噬细胞数量增加为典型特征。RA相关自身免疫及生物标志物的改变是在黏膜部位触发的,如胃肠道、口腔等部位,当肠黏膜屏障完整性被破坏后,导致黏膜通透性增加,造成相关细菌产物向血清和淋巴器官的移位,故RA患者DAO、细菌内毒素、D-乳酸水平显著升高。而肠上皮细胞形成的动态物理屏障通过细胞旁途径严格控制抗原的运输,当肠黏膜受到内源性、外源性等不同抗原刺激时,易产生大量sIgA,其能包裹有害病原体抗原且有效中和毒素,抑制病原体黏附于肠上皮表面。本研究中,RA组sIgA水平低于对照组。说明RA患者存在明显的黏膜免疫功能紊乱,抵御外来病原微生物的能力减弱,当DAO、细菌内毒素、D-乳酸水平升高、sIgA浓度降低则提示RA患者存在肠道黏膜屏障受损。另一方面,本次结果显示,RA组CD3+、CD4+、CD8+及CD16+CD56+绝对计数低于对照组,与黄懿敏[17]研究结果相似。分析原因在于:RA患者存在免疫调节紊乱,由于过度刺激NK淋巴细胞CD16+和辅助/诱导T淋巴细胞CD4+,进而导致上述细胞发生严重衰竭,且随着抑制/杀伤T淋巴细胞CD8+的损害,造成CD4+/CD8+比例失调,诱发B淋巴细胞过度增殖,引起自身抗体的大量生成。由于T淋巴细胞具有免疫调节及免疫效应的双重功效,其中抑制/杀伤T淋巴细胞CD8+发挥免疫抑制作用,而辅助/诱导T淋巴细胞CD4+通过分泌相关细胞因子来增强免疫应答过程,而上述两类细胞在功能上相互制约,共同维持机体免疫系统的平衡,若外周血淋巴细胞亚群数量及功能紊乱导致该平衡被打破,进而引起RA的发生及发展[18]。除此之外,本研究显示,辅助/诱导T淋巴细胞CD4+与血清DAO、细菌内毒素、D-乳酸水平呈负相关,与sIgA呈正相关,B淋巴细胞CD19+与sIgA呈负相关。目前在已确诊的RA和RA前期的患者中已观察到肠道通透性改变的迹象,肠道菌群在免疫系统的诱导和功能以及个体对自身抗原的反应中起着基础性作用。由于自身抗体可在发炎的肠道内产生,当肠道炎症及屏障功能损伤时,肠道组织中的相关免疫细胞可进入全身部位和关节,关节组织通常被 T 细胞、B 细胞和巨噬细胞等免疫细胞浸润,产生多种促炎细胞因子,促进炎症并最终导致组织破坏,引起RA的发生[19]。而B淋巴细胞存在于肠系膜淋巴结及派氏淋巴结等肠道相关淋巴组织中,肠道微生物代谢产物及相关抗原易促进黏膜浆细胞的分化,易加快B细胞类别转换至IgA型细胞,其中富含IgA的浆细胞在免疫应答过程中可分泌大量sIgA。本研究只初步探讨肠黏膜屏障功能及sIgA二者与外周血淋巴细胞亚群的关系,为RA肠道研究提供新证据,但具体的影响机制仍需进一步分析。

综上所述,RA患者DAO、细菌内毒素、D-乳酸水平升高,sIgA水平降低;二者与辅助/诱导T淋巴细胞CD4+相关。