袁晓军 徐文华 李广 林军明 甘心荣

黄韧带骨化(ossification of ligamentum flavum, OLF)在临床较多见, 好发于胸椎, 常压迫脊髓致神经功能受损, 严重者出现瘫痪。血管生成是黄韧带骨化的重要原因之一, 而研究发现VEGF 在诱导血管生成中起重要作用。姜黄素是从姜科姜黄属植物根茎姜黄(turmeric)中提取的一种植物多酚, 药性稳定且无相关毒副作用, 除了有抗炎及抗氧化效果外, 还具备一定抗肿瘤价值, 受到临床的高度关注。近年来, 随着临床研究的深入, 发现基质金属蛋白酶家族中MMP-9 是姜黄素抗血管生成的重要机制；姜黄素呈时间依赖性抑制腹水肿瘤细胞VEGF-1 和VEGF-2 基因的表达。目前对姜黄素的研究多集中于对肿瘤的研究, 但关于姜黄素对黄韧带骨化的发生发展影响的研究较少。探讨姜黄素对黄韧带骨化中血管生成的作用研究, 有助于更好地认识黄韧带骨化的发生原因, 为姜黄素可能成为一种临床中具有治疗黄韧带骨化的中药提供理论依据［1,2］。为此, 本文选取40 只脊柱黄韧带骨化大白兔为研究对象, 对姜黄素在抑制脊柱黄韧带骨化过程中血管增生的应用价值分析并报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 选取40 只脊柱黄韧带骨化大白兔为研究对象, 本次订购的大白兔来自于江苏省农科院, 雌雄不限, 大白兔平均体质量(2.44±0.15)kg, 将所有大白兔按照随机数字表法分为对照组2、试验组2、试验组1、对照组1, 每组10 只。其中, 姜黄素为上海化学试剂总厂试剂三厂所产, 阿托伐他汀钙的生产厂家为辉瑞公司, 其他试验材料包括：Weigert 氏间苯二酚品红染液, 随机引物(random primer), 丽春红S 染色液,上海华美所产的RNA 酶抑制剂 RNasin Ribonuclease Inhibitor, 上海放射免疫分析技术研究所所产的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)放射免疫分析试剂盒, Takara 所产的EX Taq DNA 聚合酶(EX Taq DNA Polymerase), 南京聚力生物医学工程研究所所产的丙二醛测定试剂盒, M-MLV 反转录酶(M-MLV Reverse Transcriptase)(promega), JEM-1010 型透射电镜JE.OL,北京祥瑞生物制品股份有限公司所产的白细胞介素-6放射免疫试剂盒, 采用722 分光光度计。

1. 2 方法 大白兔先行模型构建, 即建立黄韧带骨化模型：参照陈雄生等方法, 以中国大白兔为实验对象,采用重组人骨形态发生蛋白(BMP-2)作为诱导物, 将BMP-2 明胶海绵复合载体植入黄韧带下方间隙。试验组1 植入含姜黄素的复合载体, 对照组1 植入含PBS的复合载体, 试验组2 灌胃姜黄素, 对照组2 灌胃生理盐水, 生理盐水剂量为5 ml/d, PBS 复合载体组应用含聚丁二酸丁二醇酯干预, 使用剂量为2.0 mg/(kg·d), 在持续干预4 周后检查四组大白兔的黄韧带中血管增生情况。

1. 3 观察指标 在持续干预4 周后检查四组大白兔的黄韧带血管增生情况, 比较四组VEGF、MMP-9、MVD、白细胞介素-6、超氧化物歧化酶、丙二醛、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、p53、Caspase-3 水平。再将大白兔喂养5 周后应用乌来糖实施麻醉处理, 剂量为1 g/kg, 并实施心脏穿刺抽血, 采集血液样本后放置在试管, 于37℃环境中水浴30 min, 常规进行离心血清分离, 应用自动生化分析仪(日本)对血脂水平进行检测, 将一部分血清放入冰箱备检, 对超氧化物歧化酶、丙二醛、白细胞介素-6 等指标进行检测, 对脂质降解物当中所含有的丙二醛结合硫代巴比妥酸做氧化处理后产生红色产物, 通过硫代巴比妥酸比色法对丙二醛含量进行检测,血清中的超氧化物歧化酶含量检测通过放射免疫法进行, 白细胞介素-6 水平检测采用平衡法, 常规病理及弹力纤维染色的具体步骤为：在大白兔饲养第4 周末,应用乌来糖对大白兔进行麻醉, 依次完成椎管切开, 行黄韧带组织分离, 并对组织行VEGF［积分光密度(IOD)值］和MMP-9 检测、组织分离、甲醛固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红染色法(HE)染色、Weigert弹力纤维染色［3,4］。

1. 4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 四组VEGF、MMP-9、MVD 水平比较 四组VEGF、MMP-9 水平由高到低为：对照组2＞试验组2(对照组1)＞试验组1, 差异均具有统计学意义(P＜0.05)；试验组2、对照组1＞试验组1, 差异有统计学意义(P＜0.01)；试验组2 与对照组1 比较, 差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 四组VEGF、MMP-9、MVD 水平比较( ±s)

表1 四组VEGF、MMP-9、MVD 水平比较( ±s)

注：与对照组2 比较, aP＜0.05；与试验组1 比较, bP＜0.01

组别只数VEGF(pg/ml)MMP-9(μg/L)MVD(个/mm2)对照组210833.55±123.3952.45±4.7443.55±4.42试验组210364.26±33.63ab 44.19±3.52ab 37.26±4.58ab对照组110359.14±33.47ab 43.25±3.37ab 34.14±4.52ab试验组110 92.63±12.88a 33.76±2.37a 25.63±3.91a

2. 2 四组白细胞介素-6、超氧化物歧化酶、丙二醛水平比较 对照组2 白细胞介素-6 均高于试验组2、对照组1 和试验组1, 且试验组1 均低于试验组2 和对照组1；试验组1 超氧化物歧化酶均高于对照组2、试验组2 和对照组1；试验组1 的丙二醛均低于对照组2、试验组2 和对照组1, 且对照组2 均低于试验组2 和对照组1, 差异具有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

表2 四组白细胞介素-6、超氧化物歧化酶、丙二醛水平比较( ±s)

表2 四组白细胞介素-6、超氧化物歧化酶、丙二醛水平比较( ±s)

注：与对照组2 比较, aP＜0.01；与试验组1 比较, bP＜0.01

组别只数白细胞介素-6(ng/L)超氧化物歧化酶(μg/L)丙二醛(μmol/L)对照组210827.53±59.86273.68±70.59b 6.63±1.53b试验组210 715.41±50.81ab224.74±56.55b12.98±2.62ab对照组110 713.58±47.64ab225.28±54.17b11.75±2.54ab试验组110 642.88±40.21a 652.63±150.432.22±0.34

2. 3 四组血脂水平比较 对照组2 甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇水平均高于试验组2、对照组1、试验组1, 高密度脂蛋白胆固醇均低于试验组2、对照组1、试验组1, 差异具有统计学意义(P＜0.01)。见表3。

表3 四组血脂水平比较( ±s, mmol/L)

表3 四组血脂水平比较( ±s, mmol/L)

注：与对照组2 比较, aP＜0.01

组别只数甘油三酯低密度脂蛋白胆固醇总胆固醇高密度脂蛋白胆固醇对照组2101.69±0.180.57±0.051.98±0.160.68±0.05试验组210 1.15±0.16a 0.45±0.04a 1.54±0.14a 0.81±0.07a对照组110 1.22±0.11a 0.45±0.04a 1.56±0.15a 0.80±0.08a试验组110 0.92±0.09a 0.32±0.02a 1.06±0.09a 0.98±0.09a

2. 4 四组p53、Caspase-3 水平比较 通过电镜检查结果显示试验组1 存在明显的平滑肌细胞凋亡, 其凋亡基因p53、Caspase-3 均高于对照组2、试验组2 和对照组1, 差异具有统计学意义(P＜0.01)。见表4。

表4 四组p53、Caspase-3 水平比较( ±s)

表4 四组p53、Caspase-3 水平比较( ±s)

注：与试验组1 比较, aP＜0.01

组别只数p53Caspase-3对照组2100.3941±0.2082a0.4487±0.1102a试验组2100.4071±0.1439a0.9656±0.1183a对照组1100.4068±0.1447a0.9671±0.1159a试验组1100.6887±0.23851.4087±0.1628

3 讨论

黄韧带骨化虽由Double 于1912 年首先发现并描述, 在东方人种发病多见, 日本报道发生率最高达34%。OLF 在颈、胸、腰椎均可发生, 但以下胸椎多见,是胸椎管狭窄症的主要原因, 导致神经根、脊髓损伤或受压, 出现肢体感觉异常、肌力下降等严重后果［5,6］。

黄韧带骨化的典型病理变化为软骨内化骨, 早期阶段表现为纤维结构排列顺序混乱, 弹性纤维程度逐渐下降, 胶原纤维产生了明显变化(异常增生、肿胀、黏液性变样), 随着病情发展会演变为黄韧带组织当中的未分化间充质产生了细胞软骨性变化, 并导致出现纤维软骨细胞, 软骨逐渐进入钙化状态并随着新生血管的出现, 机体当中的钙盐结晶体缓慢钙化、骨化［3］。黄韧带骨化的原因较多, 包括生物力学改变、解剖与力学因素、退变因素、炎性细胞因子等因素［4］, 以骨形态发生蛋白(BMPs)和转化生长因子-β(TGF-β)所起作用最明显。研究发现, 正常情况下, 韧带当中并不存在太多的微血管, 韧带、骨化移行区域则有大量微血管存在, 同时还有CD34+内皮组细胞, 提示血管生成在韧带由正常向变性阶段进展过程中发挥作用, 钙化区域的肥大软骨细胞, 在分泌生长因子的调节、刺激之下生成诸如VEGF 的血管, 新生血管会增加间质细胞滤过、基质矿化, 这都是骨化出现的重要前提, 而骨桥蛋白等是钙化成熟的标志, 在相关研究中提出, 局部内皮细胞分泌的有利环境(缺氧、VEGF 的高表达)在损伤康复中扮演重要角色, 显示了VEGF 促进骨生成和血管生成的效果, BMPs 发挥着不可忽视的介导价值［7,8］。

姜黄素是从姜科姜黄属植物的根茎姜黄中提取的一种植物多酚, 目前对其作用机制的研究多集中于姜黄素对肿瘤细胞粘附及运动、基质金属蛋白酶(MMP)、核因子-κB(NF-κB)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)的影响, 抑制血管的生成［9,10］。基质金属蛋白酶家族中MMP-9 是姜黄素抗血管生成的重要机制。还有研究发现, 姜黄素抑制腹水肿瘤细胞VEGF-1 和VEGF-2基因的表达呈时间依赖性［11,12］。本次研究结果显示,对照组2 甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、白细胞介素-6 均高于试验组2、对照组1、试验组1,高密度脂蛋白胆固醇均低于试验组2、对照组1、试验组1, 差异具有统计学意义(P＜0.01)。黄韧带血管增生程度也最高。四组VEGF、MMP-9 水平由高到低为：对照组2＞试验组2(对照组1)＞试验组1, 差异均具有统计学意义(P＜0.05)；试验组2、对照组1＞试验组1,差异有统计学意义(P＜0.01)；试验组2 与对照组1 比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。试验组1 超氧化物歧化酶均高于对照组2、试验组2 和对照组1, 试验组1 的丙二醛均低于对照组2、试验组2 和对照组1, 且对照组2 均低于试验组2 和对照组1, 差异具有统计学意义(P＜0.01)。通过电镜检查结果显示试验组1 存在明显的平滑肌细胞凋亡, 其凋亡基因p53、Caspase-3 均高于对照组2、试验组2 和对照组1, 差异具有统计学意义(P＜0.01)。

综上所述, 姜黄素对脊柱黄韧带骨化过程中血管增生具有抑制作用, 分析其原因可能是由于姜黄素能够抑制VEGF、MMP-9 的表达, 抑制脊柱黄韧带的发生发展。