杨挲挲 韩鹏飞 赵乐 李梦真 查江杰 程铭

缺血性脑卒中(ischemic stroke, IS)在我国是一种比较常见的心血管疾病, 该疾病的特点是发病例数多,并且患者残疾率、复发率以及死亡率都比较高［1］, 对人们的身体和精神健康有极大的威胁。近年来静脉溶栓在IS 治疗中取得了很大进展, 但IS 患者有限的治疗窗口仍然是临床救治中的一个巨大挑战［2］。因此早期诊断及寻找新的生物标志物对监测疾病进展和改善IS尤为重要。LncRNA 是一种调控分子, 通过转录和转录后途径来控制靶基因的表达并且通过改变动脉粥样硬化、炎症、细胞存活和血管生成来参与IS 的病理过程［3］。研究显示, 生长阻滞特异转录物5(growth arrestspecial transcript 5, GAS5)是多种癌症的肿瘤抑制因子［4］。最近的研究也将LncRNA GAS5 与血管疾病联系起来。多项证据表明LncRNA GAS5 参与了调控血管狭窄、炎症和神经细胞凋亡［5］。然而, 大多数LncRNA GAS5 在IS 中的研究主要为其在IS 病理生理中的作用,而对其临床价值的研究相对较少［6］。因此, 本研究旨在探讨LncRNA GAS5 与IS 患者病情严重程度相关性及临床应用价值, 以期从分子生物学水平上为IS 的诊断、治疗提供新的方向, 报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2021 年9 月～2022 年11 月在牡丹江医学院附属红旗医院就诊的90 例IS 患者作为病例组, 平均年龄(59.56±4.68)岁；其中男58 例, 女32 例。将病例组患者按照IS 严重程度分为轻度组、中度组、重度组, 每组30 例。另选取同期健康体检者45 例作为健康对照组, 平均年龄(60.40±5.76)岁；其中男27 例, 女18 例。病例组和健康对照组一般资料比较,差异无统计学意义(P＞0.05), 具有可比性。在实验开始前本研究已通过医学伦理委员会批准, 且受试者均需在实验正式开始前了解知情同意书内容并确认自愿参与实验。实验材料为受试者的新鲜血清, 且采集血清的时间不得＞6 h, 血清收集完毕后置于-80℃冰箱保存。病例组纳入标准：①依据《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2022》相关内容, 患者在实验开始前需要证明其确实患有IS, 证明材料可以是头部CT 结果或磁共振成像(MRI)诊断；②年龄45～70 岁。健康对照组纳入标准：①年龄45～70 岁；②无心脑血管疾病及其他基础疾病。排除标准：①先天性或获得性心血管疾病；②肝脏、肾脏等重要脏器均已出现一定的功能障碍；③患者还患有血管性肿瘤, 且该肿瘤为恶性肿瘤；④严重感染或自身免疫性疾病；⑤孕妇或哺乳期妇女。

1. 2 方法

1. 2. 1 主要试剂和仪器 总RNA提取试剂使用TRIpure Total RNA Extraction Reagent 试剂(ELK Biotechnology 生产)、逆转录试剂使用Strand cDNA Synthesis Kit(EntiLink™ 1st生产)、目的基因提取试剂使用SYBR Green PCR SuperMix(EnTurbo™生产)；PCR 引物［生工生物工程(上海)股份有限公司设计］；PCR 仪(型号：基因扩增仪TC-XP)购自杭州博日科技股份有限公司；荧光定量PCR 仪( 型号：StepOne™ Real-Time PCR System)购自LifeTechnologies；制冰机(型号IMS-20)购自常熟市雪科电器有限公司；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇均来自国药集团化学试剂有限公司；RNase Free 水为自配。

1. 2. 2 收集血清标本 采集所有受测者外周全血5 ml于普通生化管, 静置15 min, 静置温度为室温即可, 下一步进行离心操作, 将离心时间设置为10 min, 离心速度设置为4000 r/min, 离心时提前准备好无菌无酶EP管, 用于转移离心上清液, 于-80℃储存。

1. 2. 3 总RNA 提取和逆转录 取出血清于常温下解冻用于总RNA 提取。首先准备好1.5 ml 无菌无酶EP管, 加入血清, 血清体积为250 μl。然后依次加入1 ml TRIpure、250 μl 三氯甲烷, 每加入一项试剂后都需要将混合物摇匀, 之后静置5 min, 混合静置均需在冰上进行操作。混匀静置后进行离心操作, 离心温度为4℃,离心速度为10000 r/min, 离心时间为10 min。之后取上清液500 μl, 置于EP 管中, 并将500 μl 异丙醇加入上清液中沉淀, 异丙醇加入前要经过4℃预冷。之后将上清液和异丙醇的混合物混合均匀, 静置15 min, 静置温度为-20℃。之后需要再次离心, 离心速度、温度、时间均与第一次离心时保持一致, 将上清液转移至新的EP 管中, 加入1 ml 75%乙醇, 加入前乙醇也要先在4℃预冷, 之后来回颠倒几次后, 再次离心5 min, 离心温度和速度均保持不变, 离心结束后再次将上清液倒出, 沉淀干燥几分钟后加入100 μl RNase Free 水, 使得到的RNA 充分溶解。提取出的RNA 经超微量分光光度计检测其纯度。使用ELK Biotechnology 逆转录试剂盒进行逆转录, 操作严格按照说明书。需注意的是反应液的配置应在冰上进行, 之后于PCR 仪上进行操作。

1. 2. 4 LncRNA GAS5 检测 qRT-PCR 可以对病例组患者血清中LncRNA GAS5 表达情况进行实时检测。内参基因可以选择Actin。按照试剂盒说明书操作, 扩增时使用的仪器为StepOne™ Real-Time PCR 仪。扩增条件：①进行预变性, 预变性温度为95℃, 时间设置为3 min, 只进行1 个循环；②进行变性, 变性温度设置为95℃, 变性时间为10 s；③复性, 温度设置为58℃, 时间为30 s；④延伸, 温度设置为72℃, 时间为30 s。第②、③、④步共设置40 个循环。预根据仪器默认设置来做熔解曲线。LncRNA GAS5 的相对表达量=2-ΔΔCT。引物为：Actin-F：5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3'；ACTIN-R ：5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3' ；LncRNA GAS5-F：5'-CTTGCTTGGGTAAGGACATG-3'；GAS5-R：5'-GTTTAGGATAACAGGTCTGCCTG-3'。

1. 3 观察指标 比较四组血清LncRNA GAS5 表达水平, 分析病例组患者LncRNA GAS5 相对表达水平与NIHSS 评分的相关性以及microRNA-27a 对IS 的诊断效能。

1. 4 统计学方法 采用SPSS25.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t 检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。在利用数据绘图时, 使用的软件为GraphPad Prism 8。相关性分析采用Pearson 相关系数, 绘制ROC 曲线判断LncRNA GAS5 的诊断效能。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 四组血清LncRNA GAS5 表达水平比较 qRTPCR 结果表明：LncRNA GAS5 在健康对照组以及轻度组、中度组、重度组中的表达水平分别为(1.12±0.97)、(2.17±1.16)、(3.20±1.24)、(5.07±1.97), 轻度组、中度组、中度组LncRNA GAS5 表达水平高于健康对照组, 且重度组LncRNA GAS5 表达水平高于中度组和轻度组, 中度组高于轻度组, 差异均具有统计学意义(P＜0.001)。见图1。

2. 2 病例组患者LncRNA GAS5 相对表达水平与NIHSS 评分的相关性分析 经Pearson 相关性分析表明, 病例组患者LncRNA GAS5 相对表达水平与NIHSS评分呈正相关(r=0.63, P＜0.01)。见图2。

图2 病例组患者LncRNA GAS5 相对表达水平与NIHSS 评分的相关性分析

2. 3 LncRNA GAS5 对IS 的诊断效能分析 通过ROC曲线分析, LncRNA GAS5 的AUC 为0.893(0.836～0.950),灵敏度为93.3%, 特异度为68.9%, 截断值为1.18。见图3。

图3 LncRNA GAS5 对IS 诊断效能的ROC 曲线

3 讨论

中国是脑卒中大国, 据推算, 现在心血管疾病患者高达3.3 亿, 其中患脑卒中为1300 万人。全球疾病负担研究(GBD)研究还显示, 2019 年脑卒中是中国第一大死因［7］。IS 是脑卒中最常见的类型, 血压血脂过高、糖尿病、吸烟等都有可能引发脑卒中［8］。缺血引起的损伤和神经元细胞的死亡, 可能还会导致残疾,给个人和社会造成了沉重负担［9］。因此, 发掘新的、安全无创、高效准确的生物标志物对于早期预防并诊断IS 尤为重要。

LncRNA GAS5 被首次发现在受生长抑制的小白鼠NIH3T3 纤维化细胞中过表达［10］。随后, 科研人员们对LncRNA GAS5 进行了深入的研究。发现LncRNA GAS5 位于1q25.1 号染色体上, 是由630 个核苷酸构成的［11］。研究结果证明, LncRNA GAS5 是一种对细胞增殖和凋亡有重要调控作用的LncRNA, 在人体组织中广泛表达。目前已经有研究证实, LncRNA GAS5 在许多肿瘤中都呈现出低表达状态, 且它表达量的高低影响着肿瘤的发生发展情况［12］。近年来随着研究者的深入发现表明, LncRNA GAS5 在心脑血管疾病、内分泌代谢性疾病以及自身免疫性疾病等非肿瘤性疾病中也发挥重要作用［13］。

有报道显示, LncRNA GAS5 在IS 患者的斑块中表达显著高于正常人［14］。而IS 的病理生理学基础之一就是动脉粥样硬化, 所以认为LncRNA GAS5 表达与IS存在一定的关系。然而, 关于LncRNA GAS5 与IS 的研究较少, 且大多为动物和细胞模型实验。比如, Shen等［15］发现干扰LncRNA GAS5 的表达能通过 miR-34b-3p/EPHA4 轴减轻脑微血管内皮细胞中氧-葡萄糖剥夺/再灌注(OGD/R)诱导的损伤。Wang 等［16］发现在脑卒中大鼠模型中, LncRNA GAS5 下调可以通过miR-9/FOXO3 轴来减轻神经元细胞损伤。此外, Jiang等［17］研究表明干扰LncRNA GAS5 的表达可以通过miR-4/STAT1192A 轴抑制AQP5 进而阻断实验性脑缺血再灌注损伤。

因此本研究收集了IS 患者与健康体检者血清进行分析。采用qRT-PCR 技术检测LncRNA GAS5 在血清中的表达情况, 发现病例组各小组LncRNA GAS5 表达水平高于健康对照组, 且重度组LncRNA GAS5 表达水平高于中度组和轻度组, 中度组高于轻度组, 差异均具有统计学意义(P＜0.001)。此外, 为了进一步分析, 本文还采用Pearson 相关性分析对LncRNA GAS5 相对表达水平与NIHSS 评分进行分析, 运用ROC 曲线分析了LncRNA GAS5 表达对IS 的诊断价值。结果显示：病例组患者LncRNA GAS5 相对表达水平与NIHSS 评分呈正相关(r=0.63, P＜0.01)。LncRNA GAS5 的AUC 为0.893(0.836～0.950), 灵敏度为93.3%, 特异度为68.9%,截断值为1.18。LncRNA GAS5 对IS 诊断有较好的预测价值。这些数据表明, LncRNA GAS5 可能是一种有利于IS 风险诊断的新型生物标志物。

这项实验仍然有一些不足之处, 比如实验样本数量比较少, LnRNA GAS5 表达水平可能存在一定偏倚,日后需加大样本量进行研究；尚未运用Logistic 回归分析对IS 的危险因素进行研究；尚未对LnRNA GAS5表达对于IS 预后的评估价值进行深入探讨。研究应将IS 的危险因素以及预后临床资料纳入研究范围, 以更加明确LnRNA GAS5 在IS 中的临床应用价值。

综上所述, IS 患者与健康体检者取新鲜血清检测后发现, LncRNA GAS5 表达在IS 患者血清中出现明显升高, 且患者病情越严重表达水平越高, 因此可以将LncRNA GAS5 表达水平作为IS 的辅助生物诊断指标。