刘晓芹 李涛 董华 李文

替加环素属于新型静脉注射用抗生素, 抗菌效果显著, 对重症感染患者有良好的临床效果, 能够有效消除感染指征［1-3］。对于重症医院获得性肺炎患者, 替加环素是重要的治疗药物, 但血药浓度个体差异明显, 少数患者使用后可能出现生命危险, 监测血药浓度以严格控制剂量十分关键［4］。基于此, 本次研究一种测定重症医院获得性肺炎患者体内替加环素含量的新型二维色谱系统方法, 旨在确保用药安全。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 将2020 年1 月～2022 年6 月接收的60 例重症医院获得性肺炎患者视为研究对象, 医院伦理会批准研究实施。纳入标准：①参照《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南(2018 年版)》［5］, 诊断为重症医院获得性肺炎患者；②均接受替加环素治疗。排除标准：①院前感染；②合并肺癌等恶性肿瘤；③存在其他感染性疾病；④对替加环素过敏。

1. 2 方法

1. 2. 1 仪器 全自动二维液相色谱系统(ALK-108, 湖南德米特仪器有限公司)；第一维色谱系统用于样品预分离, 第二维色谱系统用于样品分离监测, 包括高压输液泵、自动进样器、四元低压色谱泵等, 均来自湖南德米特科技有限公司；电子分析天平(FA1004, 鹤壁精中科技有限公司)；旋涡混合器(XW-80A, 上海琪特分析仪器有限公司)；离心机(MINI-15K, 杭州奥盛仪器有限公司)。

1. 2. 2 试剂 一维试剂为TGCL-1A(500 ml/瓶, 批号：20210915, 成分为甲醇、乙腈、水、磷酸氨)；二维试剂为TGCL-2B(500 ml/瓶, 批号：20211123, 成分为甲醇、乙腈、水、磷酸氢二钠)；辅助试剂为超纯水, 乙腈、甲醇(色谱纯)；高氯酸(批号：7601-90-3, 成都中锦隆科技发展有限公司, 纯度76%)。

1. 2. 3 色谱条件 第一维色谱系统中一维液相色谱柱为(SX15-1A 3.5 mm×50 mm, 5 μm), 流动相：乙腈∶甲醇∶磷酸盐=10∶5∶9(V/V/V), pH 为5, 中间色谱柱为双通柱, 二维色谱柱为(SCB-2A 4.6 mm×250 mm,5 μm), 流动相：乙腈∶甲醇∶磷酸氢二钠=7∶22∶16(V/V/V)。流速设置为1 ml/min, 柱温45℃, 检测波长CH1: 340 nm CH2: 269 nm, 进样体积200 μl。

1. 2. 4 溶液制备 溶液制备包括调试液、质控品与校准品, 其中调试液为替加环素冻干调试液(5×1 ml/盒,批号：20200407)；质控品为TGCL-1FA 质控品(1 ml/支,批号：20211026)；校准品为TGCL-1FA 校准品(1 ml/支,批号：20211026)。

1. 2. 5 血清样本处理 严密采集血清样本0.5 ml, 将其放在EP 管中, 加入对应质量浓度的替加环素溶液35 μl, 旋涡振荡30 s, 再加入0.4 mol/L 高氯酸180 μl, 旋涡振荡60 s, 以14500 r/min 的速度离心8 min, 取上清液1 ml, 进样250 μl。

1. 3 观察指标 观察新型二维色谱系统测定替加环素的效果, 指标包括运行时间、标准曲线与线性范围、绝对回收率、精密度与准确度、稳定性, 并观察临床测定重症医院获得性肺炎患者血清中替加环素的效果。

2 结果

2. 1 运行时间 在规定的色谱条件下, 替加环素的色谱峰总运行时间为10.0 min, 保留时间为6.9 min, 其中第一维工序和捕获工序时间为3.5 min, 第二维分离时间为5.5 min, 且色谱峰在该阶段没有干扰峰和受其他因素干扰。

2. 2 标准曲线与线性范围 用替加环素标准储备溶液配制成浓度分别为50、550、950、1500、2500 ng/ml的含药血清样本, 根据上述血清样本处理方法, 处理后实施进样分析, 获得色谱图。将浓度视为自变量(X), 峰面积视为因变量(Y), 展开回归计算, 替加环素浓度在1500～2500 ng/ml 的线性关系最好, 标准曲线为Y=aX+b(a=81.9350, b=-497.920), r=0.999。

2. 3 绝对回收率 严密称取950、1500、2500 ng/ml 低、中、高质量浓度的替加环素质控样品, 经“1.2.5”项方法下处理和“1.2.3”项下色谱条件进样, 与相应浓度的替加环素对照品工作液峰面积比较, 发现绝对回收率分别为94.9%、95.3%、96.2%, 符合转移回收率要求(90%～110%)。

2. 4 精密度与准确度 配制替加环素定量下限质量浓度50 ng/ml 血浆样品, 严密称取950、1500、2500 ng/ml低、中、高质量浓度的替加环素质控样品, 经“1.2.5”项方法下处理和“1.2.3”项下色谱条件进样, 连续测定3 d, 每个浓度各取6 份样本评估, 获得替加环素的日内与日间精密度、准确度。日间、日内精密度均＜3%。见表1。

表1 替加环素的日内与日间精密度、准确度(%)

2. 5 稳定性 950、1500、2500 ng/ml 低、中、高质量浓度的替加环素质控样品, 分别在室温条件下放置0、4、8、12 h, 反复冻融2 次, 在-20℃环境下储存0、10、20、30 d 后, 经“1.2.5”项方法下处理和“1.2.3”项下色谱条件进样, 测定各浓度水平数值的精密度均＜7.6%, 表明该实验条件下的血清中的替加环素稳定性好。

2. 6 临床应用 用本方法测定重症医院获得性肺炎患者血清中的替加环素质量浓度, 给药方式均为静脉滴注, 维持剂量为50 mg 或100 mg, 在药物浓度达到稳定状态12 h 后采集静脉血, 经“1.2.5”项方法下处理血清样本和“1.2.3”项下色谱条件进样分析, 显示用药后血药浓度范围在0.113～0.824 μg/ml, 满足血清中替加环素浓度检测标准。见表2。

表2 临床应用分析

3 讨论

医院作为主要的诊疗场所, 每天接收大量患者,各种药物与医疗器械使用频繁, 极易出现院内接触传播的病原菌, 如部分患者不注重手卫生导致病原菌传播, 加上患者自身免疫力低下, 医院获得性肺炎发生率高［6］。老年患者因为合并糖尿病等慢性疾病, 同时可能留置尿管、气管插管, 是发生多重耐药鲍曼不动杆菌肺部感染的高危人群, 替加环素是治疗院内感染的有效药物, 效果优于单纯头孢哌酮舒巴坦, 能够快速减轻机体炎症反应［7-9］。

不过随着临床耐药性的提高, 合理应用替加环素具有重要意义, 且任何药物均存在一定毒性作用, 如何在保证安全的前提下最大化增强药物疗效是临床需重点关注的问题, 而血药浓度是调整用药方案的重要依据, 有必要提高血药浓度监测精确度［10］。目前监测血药浓度方法有质谱分析、高效液相色谱检测等。马霖等［11］在研究中发现, 高效液相串联质谱系统同时测定人血浆中伏立康唑和替加环素的浓度效果令人满意, 精密度控制在6.48%～14.37%, 准确度在85.20%～107.08%, 平均提取回收率超过90.50%, 稳定性好, 不仅样本处理简便, 且灵敏度高, 专属性强。但高效液相色谱存在“柱外效应”, 在进样到检测器之间, 若流动相的流型发生变化, 被分离物质的任何扩散与滞留都将造成色谱峰加宽, 柱效率下降［12,13］。二维色谱是最早用于纸色谱和薄层色谱的化学分析方法,由于二维电泳在蛋白组学研究中十分活跃, 能够检测存在差异化的蛋白［14］。血药浓度监测精确度主要受干扰峰影响, 本次研究提出一种新型二维色谱血药浓度监测方法, 结果色谱峰未出现干扰峰, 950、1500、2500 ng/ml 低、中、高质量浓度的替加环素质控样品绝对回收率符合转移回收率要求(90%～110%), 日内与日间精密度＜3%, 同时稳定性好, 在具体临床应用中精准测得替加环素血药浓度, 提示该种方法具有较高的应用价值。这是因为新型二维色谱系统运用三根色谱柱, 分别为一维色谱柱、中间色谱柱与二维色谱柱, 依次对血样实施富集、转移与分离, 去掉大量杂质, 改善分离能力, 减少其他干扰, 提高精密度［15］。另外, 利用聚焦体系在规定时间内改变流动相比例, 让药物呈点状进入色谱柱, 避免体积过大进样应药物分散造成扩散误差［16］。

综上所述, 新型二维色谱系统是一种可靠的重症医院获得性肺炎患者中替加环素含量测定方法, 操作简便, 精密度高, 但由于替加环素血液中浓度较低, 对临床治疗效果预测作用仍需进一步研究。