雷建军 张 贺

(中国人民解放军北部战区总医院实验动物室,沈阳 110015)

在军事行动及作战训练期间,军事人员时常暴露在爆炸形成的冲击波中,可能导致多种脏器损伤,爆炸产生的脑损伤被认为是当前军事行动和作战训练的“隐形伤害”[1]。脑组织爆震伤(blast-related traumatic brain injury,bTBI)损伤程度取决于爆炸能量和离爆炸震中的距离等因素[2-3],有文献表明[4],创伤后应激障碍、精神或身体异常和终身残疾与此相关[5-6]。对伤员、其家庭和社会造成了巨大的伤害。

有研究统计,在美军作战人群中,因爆炸造成的伤害占 78%,导致越来越多的人员罹患 bTBI[7]。调查涉及 3 952 名美军士兵,有 587 名被诊断患有脑震荡,其中 72.2%的患者损伤原因是爆炸所致[8]。同时bTBI 患者还会出现包括认知/行为障碍、创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder,PTSD)、慢性脑病、癫痫、阿尔茨海默病在内的多种个体化疾患[9],造成严重的社会医疗负担。

目前,脑组织爆震伤研究成为军事医学研究的重点领域。理想的脑组织爆震伤模型能够为进一步科学研究提供基础,如何精准的控制脑组织损伤程度是本研究重点内容。研究中采用点爆震源对大鼠进行不同距离爆震,探讨建立一种安全、稳定、简便的大鼠脑组织爆震伤模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物及分组:30只SPF级雄性SD大鼠,体质量220～240 g,实验动物购自北京斯贝福生物科技有限公司,生产许可证号【SCXK(京)2019-0010】,饲养于北部战区总医院实验动物室,实验动物使用许可证编号【SYXK(辽)2022-0007】,实验动物伦理审查编号:第2021-13号。饲养温度24 ℃,采用10/14昼夜间断照明,自由饮食饮水。随机将大鼠分为Control组(对照组)、爆震A组(爆震点位距离大鼠头部7 cm)和爆震B组(爆震点位距离大鼠头部9 cm),每组10只。

1.1.2主要试剂:内径6 cm钢管(购自建材市场);TNT爆震装置来源(陆军某旅);苏木精染色剂(武汉塞维尔生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1模型制备:实验组大鼠禁食24 h,自由饮水,采用1%戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉,剂量45 mg/kg,保留大鼠自主呼吸。将麻醉后大鼠放在内径6 cm钢管内(壁厚8 mm),分别在距离大鼠头部7、9 cm位置放置0.1 g TNT含量的爆炸装置,进行引爆。

1.2.2神经功能学评分:利用Garcia评分[10]法来对各组大鼠的神经功能缺损情况进行评估。主要包括:(1)自发活动;(2)四肢运动的对称性;(3)前臂伸展;(4)攀爬;(5)身体本体感受;(6)对触须的反应。分数越高表明神经功能越好。

1.2.3脑组织含水量:采用脑组织干重湿重法检测大脑含水量,造模6 h后取出大鼠脑组织并称重(湿重),称重后将脑组织放在锡纸上并置于105 ℃烘箱中,进行脱水,72 h后取出称量(干重)。计算大鼠脑含水量,含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.2.4HE染色:脑组织样本使用4%多聚甲醛固定液固定,固定好组织清水冲洗,然后经70%、80%、90%、95%及100%梯度乙醇脱水,二甲苯透明两次,包埋蜡块,并切成厚5 μm的切片。将切片放置于干燥箱内设置65 ℃ 1 h将蜡挥发,二甲苯将切片进行两次脱蜡,使用乙醇(100%、95%、90%、80%和70%)梯度水化,蒸馏水浸洗3 min。苏木精染色20 min,清水冲洗15 min,盐酸乙醇分化10 s,蒸馏水浸洗1 min后,伊红染色2 min。70%、80%、90%、95%和100%梯度乙醇脱水,二甲苯透明2次,每次3 min,中性树脂封片,放置于光学显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 爆震后大鼠Garcia神经功能评分

首先对爆震后各组大鼠神经功能变化进行评分,结果如图1所示。与对照组相比,A组大鼠神经评分下降显著(P<0.05);B组大鼠神经功能评分较A组高(P<0.05)。表明爆震造成的大鼠神经功能缺损。

注:与对照组相比,*P<0.05;与A组相比,#P<0.05。Note: Compared with control group,*P<0.05;Compared with A group,#P<0.05.图1 各组大鼠Garcia神经功能评分Fig.1 Garcia nerve function scores in each group

2.2 爆震后对大鼠脑组织水肿的影响

采用干湿重法对大鼠脑组织含水量进行计算,如图2所示。与对照组相比,A组、B组大鼠脑含水量均有所增加(P<0.05),且A组较B组增加显著(P<0.05),表明爆震造成大鼠脑组织出现水肿。

注:与Control组相比,*P<0.05;与A组相比,#P<0.05。Note: Compared with control group,*P<0.05;Compared with A group,#P<0.05.图2 各组大鼠脑含水量Fig.2 Brain water content of rats in each group

2.3 爆震后对大鼠脑组织进行HE染色

如图3所示,与对照组相比,A组、B组大鼠脑组织均有出血,且A组较B组出血严重,表明爆震可诱导大鼠脑组织出现出血。

注:与Control组相比,*P<0.05;与A组相比,#P<0.05。Note: Compared with control group,*P<0.05;Compared with A group,#P<0.05.图3 各组脑组织HE染色结果(×400)Fig.3 HE staining results of brain tissue in each group(×400)

3 讨论

创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是由于头部震荡伤、物体穿透、机动车事故的突然加速-减速、爆炸冲击波等外力所导致的损伤[11-12]。爆炸产生的冲击波释放出巨大的能量,其所引起的超压和低压是引起原发性爆炸损伤的主要机制。颅脑爆震伤的病理生理学是独特的,其损伤程度取决于爆炸能量和离爆炸震中的距离等因素[13]。因此,更好的诊断和治疗需要清楚的了解各类型损伤的机制。

Garcia评分对神经功能进行了较全面的评价[14],评价指标相对固定和客观,主管因素对偏倚影响较小,且可操作性好,在脑研究中得到了广泛应用。本实验采用Garcia评分对脑组织爆震伤大鼠进行神经功能评分,通过评分可以判定实验组大鼠神经功能受到影响,显示爆炸产生的冲击波对大鼠脑组织产生影响。

有研究表明[15-17],脑部发生震荡时,遭受暴力部位的细胞在显微镜下可见神经组织紊乱,线粒体肿胀、推移,神经元轴突肿胀,并有间质水肿[15]。本实验对爆炸后大鼠脑组织水肿情况进行评价,结果显示,实验组大鼠脑组织发生水肿,进一步提示爆炸产生的冲击波对大鼠脑组织产生影响。爆炸产生的冲击波对脑组织损伤常伴有颅内小血肿[18-20],或出现脑组织挫裂伤,因此,本实验采用Garcia评分、脑水肿以及脑出血情况来评价模型建立标准。

本实验采用点爆震原对大鼠进行不同距离爆震,爆震产生在内径6 cm钢管封闭环境内,可屏蔽掉其他外界干扰因素,TNT爆炸装置具有爆速及爆压,爆炸后没有碎片产生,不会对大鼠进行二次伤害,能够较好的模拟爆炸冲击波单一因素造成的损伤。

实验造模后6 h,分别对各组大鼠进行神经功能评分、脑水肿情况及脑组织HE染色病理变化观察,与对照组相比,实验A、B组大鼠神经功能评分降低、脑组织含水量及脑组织出血明显。A组中大鼠死亡4只,而B组无大鼠死亡,说明B组实验可建立脑组织爆震伤模型,而A组实验造成模型损伤较重且死亡率较高,因此,建议使用B组实验方法建立脑组织爆震伤模型。

综上所述,本研究将大鼠放置在内径6 cm钢管内,在距离大鼠头部9 cm位置引爆0.1 g TNT含量的爆炸装置可以建立大鼠脑爆震伤模型。通过本实验,为脑组织爆震伤研究提供一种安全、稳定、简便的模型制备方法。