牛苗苗 刘 军 高 伟 曹江北 陈 华

(中国人民解放军总医院,北京 100853)

哺乳动物的胰腺是一个由复杂细胞组成的器官,分为外分泌部和内分泌部,其中外分泌部约占95%,主要由导管细胞和腺泡细胞组成,分泌富含消化酶的胰液。内分泌部即胰岛,由至少5种内分泌细胞组成:α细胞(分泌胰高血糖素)、β细胞(分泌胰岛素)、γ细胞(分泌胰多肽)、δ细胞(分泌生长抑素)、ε细胞(分泌饥饿素)[1]。其中胰岛β细胞是体内唯一可以分泌降糖激素胰岛素的细胞,对于调控机体血糖稳态具有至关重要的作用。因此,胰腺是哺乳动物维持生命健康必不可少的重要器官之一[2]。并且,不同动物胰腺组织形态结构和细胞分布存在一定的差异[3-4]。

单细胞测序技术应用单细胞解离和新一代基因测序技术,能够对细胞群体中每一个细胞的基因组、转录组及表观基因组进行高分辨率检测,获得单个细胞的遗传信息[5]。其中,制备高活性、高质量的单细胞悬液对于后续测序开展和数据分析至关重要。2016年,研究人员应用单细胞测序技术,首次在单个细胞水平上获得了人胰岛细胞的遗传信息[6]。然而,对于不同种属动物的胰腺组织单细胞遗传信息分析,目前报道较少。本研究选取巴马小型猪、SD大鼠、C57BL/6小鼠三种动物的新鲜胰腺组织,制备了单细胞悬液,并对单细胞解离效果进行了比较,以期为后续单细胞测序的开展奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:7～8月龄普通级雄性去势巴马小型猪1头,体质量24 kg,购自北京实创生物科技技术有限公司,生产许可证号【SCXK(京)2018-0011】,使用许可证号【SYXK(军)2017-0017】。8周龄雄性SPF级SD大鼠1只,体质量316 g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。8周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠1只,体质量22.1 g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,生产许可证号【SCXK(京)2019-0010】,使用许可证号【SYXK(军)2017-0019】。本实验通过解放军总医院实验动物福利伦理委员会的审查,伦理审批号:2021-x17-131,实施过程中严格遵守其指导原则。

1.1.2试剂与仪器RPMI:1640培养基(Invitrogen生命技术有限公司, 货号11875119)。细胞筛(美天旎生物技术有限公司,货号130-098-462)。红细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司,货号R1010)。吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)双染试剂(上海睿钰生物科技有限公司,货号RE010212)。全自动细胞荧光分析仪(上海睿钰生物科技有限公司,型号Countstar Rigel S2)。

1.2 方法

1.2.1胰腺组织取材及解离:分别取巴马小型猪、SD大鼠、C57BL/6小鼠的新鲜胰腺组织,约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm一块,在RPMI 1640培养基中洗涤后剪碎。置于5 mL单细胞解离液中,37 ℃消化30 min。解离后使用70 μm细胞筛过滤,然后4 ℃, 1 200 r/min离心5 min,收集细胞沉淀。

1.2.2去除红细胞:按1∶3的比例向细胞沉淀中加入4 ℃预冷的红细胞裂解液,轻轻吹打混匀,静置裂解2～5 min后,1 200 r/min离心5 min,弃去上层红色清液,以去除红细胞。收集细胞沉淀,加入4 ℃预冷的RPMI 1640培养基,4 ℃ 1 200 r/min离心5 min,离心洗2～3次。

1.2.3AO/PI染色及细胞分析:应用AO/PI双染试剂分别对细胞核酸进行荧光标记,使用全自动细胞荧光分析仪随机选取3个视野,检测单细胞解离后的细胞数量和活力,具体指标包括:细胞活率、总细胞浓度、活细胞浓度、细胞的平均直径和平均圆度、细胞结团率。每个样品分别进行3次分析,并对三种动物胰腺组织单细胞解离效率进行比较。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 三种动物胰腺组织单细胞悬液细胞形态比较

镜检观察可发现,巴马小型猪、SD大鼠、C57BL/6小鼠胰腺组织单细胞悬液细胞形态完整、边界清楚、有少量结团,杂质及细胞碎片少(图1)。数据统计显示,SD大鼠细胞结团率最高(31.50%±1.00%),巴马小型猪次之(28.69%±0.34%),C57BL/6小鼠最低(20.80%±0.32%),三者相比均有统计学差异(图2A)。SD大鼠胰腺细胞的平均直径最大(13.59±0.07)μm,C57BL/6小鼠次之(12.56±0.06)μm,巴马小型猪最小(12.52±0.10)μm。SD大鼠与巴马小型猪、C57BL/6小鼠之间均有统计学差异(P<0.01),巴马小型猪与C57BL/6小鼠之间没有统计学差异(图2B)。平均圆度上,C57BL/6小鼠圆度最大(0.76±0.03),巴马小型猪次之(0.69±0.05),SD大鼠最小(0.62±0.01)。仅C57BL/6小鼠与SD大鼠之间有统计学差异(P<0.05),其他均无(图2C)。

注:A.巴马小型猪;B. SD大鼠;C. C57BL/6小鼠。Note:A. Bama miniature pig; B. SD rat; C.C57BL/6 mice.图1 三种动物胰腺组织单细胞悬液镜检(×10)Fig.1 Microscopy images of single cell suspension of pancreatic tissue from three different animals (×10)

注:A.细胞结团率;B.平均直径;C.平均圆度。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。Note:A. cell aggregation rate; B. average diameter; C. average roundness.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.图2 三种动物胰腺组织单细胞悬液细胞形态比较Fig.2 Comparison of cell morphology in single cell suspension of pancreatic tissue from three different animals

2.2 三种动物胰腺组织单细胞解离效果比较

AO/PI染色及全自动细胞荧光分析仪结果显示(图3),巴马小型猪(图3A)、SD大鼠(图3B)、C57BL/6小鼠(图3C)三种动物新鲜胰腺组织经细胞解离获得的单细胞悬液,随机视野下均以AO标记的活细胞绿色荧光为主,有少量PI标记的死细胞红色荧光,同时存在个别细胞结团现象。

注:A. 巴马小型猪;B. SD大鼠;C. C57BL/6小鼠。Note:A. Bama miniature pig; B. SD rats; C. C57BL/6 mice.图3 三种动物胰腺组织单细胞悬液AO/PI染色图片(×10)Fig.3 AO/PI staining images of pancreatic tissue single cell suspension from three different animals (×10)

数据统计显示(图4),SD大鼠细胞活率最高(93.52%±1.00%),巴马小型猪次之(92.91%±0.84%),C57BL/6小鼠细胞活率最低(87.42%±1.13%)。C57BL/6小鼠与巴马小型猪、C57BL/6小鼠之间均有统计学差异(P<0.05),巴马小型猪与SD大鼠相比没有统计学差异(图4A)。总细胞浓度上,巴马小型猪浓度最高(平均值1.29×106个/mL),SD大鼠次之(平均值1.08×106个/mL),C57BL/6小鼠最低(平均值1.03×106个/mL)。巴马小型猪与SD大鼠之间、SD大鼠与C57BL/6小鼠之间均没有统计学差异,但巴马小型猪较C57BL/6小鼠高,具有统计学差异(P<0.05,图4B)。活细胞浓度上,巴马小型猪浓度最高(平均值1.20×106个/mL),SD大鼠次之(平均值1.02×106个/mL),C57BL/6小鼠最低(平均值0.89×106个/mL)。巴马小型猪与SD大鼠(P<0.05)、C57BL/6小鼠(P<0.01)之间均有统计学差异,SD大鼠与C57BL/6小鼠之间没有统计学差异(图4C)。

注:A. 细胞活率;B. 总细胞浓度;C. 活细胞浓度;*P<0.05,**P<0.01。Note:A. cell viability, B. total cell concentration,C. live cell concentration.*P<0.05,**P<0.01.图4 三种动物胰腺组织单细胞悬液细胞计数结果Fig.4 Cell count results of single cell suspension of pancreatic tissue from three different animals

3 讨论

单细胞测序技术是近年兴起且发展迅速的一项检测技术,广泛应用于细胞异质性、免疫微环境、胚胎发育和细胞分化、肿瘤发生机制等领域的研究[7-11]。组织单细胞悬液的制备是单细胞测序的关键环节和重要基础。物种来源、组织类型、样本年限、处理方法、保存环境等多种因素,都会影响组织单细胞悬液制备的效率和活性[12-15]。

胰腺是一个由复杂细胞组成的器官,由导管细胞、腺泡细胞和至少5种内分泌细胞构成。采用传统测序技术很难准确获得胰腺各类型细胞的遗传信息。应用单细胞测序技术,可以从细胞图谱的角度,对胰腺组织中每一个细胞的基因组、转录组及表观基因组进行高分辨率检测,获得单个细胞的特异性遗传信息,并探索不同类型细胞间的互作方式,是研究胰腺组织异质性的良好工具。与其他组织相比,胰腺外分泌部会分泌大量消化酶,损伤胰腺中其他类型细胞,造成其单细胞悬液制备较一般组织更为困难。

本研究成功制备了巴马小型猪、SD大鼠、C57BL/6小鼠三种常用实验动物的新鲜胰腺组织单细胞悬液,为后续单细胞测序工作的开展奠定了基础。实验结果显示,三种动物胰腺组织单细胞悬液细胞形态完整、边界清楚。巴马小型猪和SD大鼠细胞活率均在92%以上,C57BL/6小鼠细胞活率相对较低,这可能与C57BL/6小鼠胰腺组织较小且细胞直径小,易受损伤相关,后期需进一步优化解离条件,提高其细胞活率。巴马小型猪总细胞浓度和活细胞浓度最高,这一结果证明,巴马小型猪胰腺组织细胞丰富,解离条件良好,但存在少量细胞结团的问题,需进一步优化条件。SD大鼠胰腺细胞平均直径较巴马小型猪和C57BL/6小鼠大,这与前期胰腺组织病理图片观察到的结果一致,证明不同物种的胰腺细胞形态也存在一定的差异。本研究也有一定的局限性,如动物数量较少,后期在本研究基础上进一步扩大动物数量、优化实验条件,探索更加高效的制备胰腺组织单细胞悬液的方案。