魏 朋 谢高倩 高玉海 何玥颖 秦 昆 陈 卓 柏 鑫 陈克明

(1.中国人民解放军联勤保障部队第940医院基础医学实验室,兰州 730050)(2.甘肃省干细胞与基因药物重点实验室,兰州 730050)

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种以低骨量和骨结构破坏,导致骨强度下降和骨折风险增加为特征的慢性疾病[1]。老年群体是发生骨质疏松的主要群体,一旦发生骨质疏松性骨折将会给患者带来严重的伤害[2]。随着我国老年人口的比例不断增加,如何防治骨质疏松成为一个亟待解决的难题。目前治疗骨质疏松的药物以西药为主,但大多存在一定的毒副作用且价格昂贵[3]。中药由于药性温和,毒副作用小且具有价格低廉等特点,已成为当前抗骨质疏松药物研究的热点之一。木香烃内酯(costunolide, CT)是属于倍半萜内酯,最早从传统中药木香中提取,现已发现其具有多种生物活性[4-7]。本课题组在前期研究中发现CT能诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,初步证明其具有促进骨形成能力[8],本研究旨在探究灌服CT对生长期大鼠的骨密度及其他骨强度相关指标的影响,为开发源自CT的抗骨质疏松新药奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:1月龄雌性SD大鼠30只,SPF级,体质量(99±3)g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,实验动物生产许可证号【SCXK(京)2019-00010】。饲养于联勤保障部队第940医院SPF级动物实验中心,实验动物使用许可证号【SYXK(军)2017-0047】。自由饮食饮水,室温为(22±2)℃,相对湿度为45%～65%。

1.1.2实验药品:木香烃内酯,纯度为98.74%,适宜保存温度为2～8 ℃,购买于成都埃法生物科技有限公司,批号:AF21052201。

1.1.3仪器:AE200电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);双能X线骨密度(bone mineral densities,BMD)仪(GE公司);AG-X系列台式电子万能试验机(岛津公司);NMC-100 Micro-CT仪【平生医疗科技(昆山)有限公司】。

1.2 方法

1.2.1分组及给药:SD大鼠随机分为3组,每组10只,分别为对照组(Control)、木香烃内酯低剂量组(Costunolide, CT-9)和高剂量组(Costunolide, CT-18)。CT组分别按9 mg/(kg·d)和18 mg/(kg·d)的剂量灌胃给药,Control组仅灌服等量蒸馏水。每周周一至周六连续给药6 d,每周称重1次并记录,根据体质量每周一进行1次药量调整。

1.2.2骨密度检测:开始灌胃给药后,所有大鼠每4周检测1次全身BMD,大鼠检测前禁食不禁水12 h。大鼠麻醉后,俯卧位置于双能X线BMD仪上检测全身BMD。待8周后给药组全身BMD显著高于对照组后,处死所有大鼠,剥离左右侧股骨及椎骨并检测其离体BMD,之后将左侧股骨固定于4%多聚甲醛固定液中,右侧股骨放入0.9%氯化钠溶液中-20 ℃保存。

1.2.3骨生物力学检测:从-20 ℃冰箱中取出股骨置于0.9%氯化钠溶液中,自然解冻,随后进行三点弯曲实验。将三点弯曲实验:股骨固定在AG-X型万能材料试验机上,仪器参数为:跨距16 mm,加载速度10 mm/min。开始后压力杆慢慢下落,直到股骨完全断裂,电脑自动记录股骨的最大载荷和弹性模量值。

1.2.4Micro-CT扫描:每组随机从固定于4%多聚甲醛中的股骨中挑选6根,进行micro-CT扫描。开启NMC-100 micro-CT仪,进行每日校准,打开采集软件cruiser,设置扫描条件为:电压70 kV,电流150 μA,分辨率为大离体仓标准模式。将骨膜标准品置于大离体仓放入仪器扫描,得到骨膜标准值并记录。然后以同样条件扫描大鼠股骨,用avatar软件进行3D重建并完成图像处理,以骨骺线下1.5～3.5 mm和5～7 mm的区域分别作为松质骨和皮质骨感兴趣区域(regions of interest,ROI),随后在骨分析区域输入骨膜标准值进行骨分析,得到Tb. N、Tb. Th、BV/TV、Tb. Sp、骨小梁体积BMD和皮质骨体积BMD等数据。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 木香烃内酯对生长期大鼠体质量的影响

实验过程中大鼠正常饮水饮食,精神状态良好。大鼠体质量整体呈上升趋势,第6周和第8周Control组体质量情况有轻微下降,实验全程各组间大鼠体质量均无显著差异(P>0.05,图1)

图1 生长期大鼠各组体质量变化(n=10)Fig.1 Changes in body weight of each group of rats in the growing period(n=10)

2.2 木香烃内酯对生长期大鼠BMD的影响

如表1,大鼠全身BMD结果显示:4周末各组大鼠全身BMD无显著差异(P>0.05)。而第8周时,CT-9组和CT-18组的全身BMD显著高于Control组(P<0.05,P<0.01)。并且CT-18组的全身BMD高于CT-9组,但无显著性差异(P>0.05)。如表2,各组大鼠离体股骨和椎骨BMD趋势与各组全身BMD结果一致。

表1 生长期大鼠全身BMD检测结果Table 1 Test results of whole body BMD of rats in growth period (g/cm2, n=10)

表2 生长期大鼠椎骨和股骨离体BMD检测结果Table 2 BMD test results of in vitro rat vertebrae and

2.3 木香烃内酯对生长期大鼠骨生物力学的影响

如表3所示,大鼠股骨生物力学检测结果显示:给药8周后,与Control组相比,CT-18组的最大载荷和弹性模量均显著升高(P<0.01),而CT-9组的最大载荷和弹性模量虽有所升高,但无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠股骨最大载荷和弹性模量Table 3 Maximum load and elastic modulus of rat femur in each group n=10)

2.4 Micro-CT扫描分析结果

股骨micro-CT最大剖面图(图2)和股骨micro-CT骨小梁三维立体图(图3)均显示:与Control组相比,CT-9组与CT-18组的骨小梁空隙明显减小,数量明显增多,连续性也更好,并且服药剂量越高效果越好。骨分析量化数据也表明:与Control组相比,CT-9和CT-18组的相对骨体积、骨小梁数和体积骨密度均显著升高,骨小梁分离度则显著下降(表4,5)。但各组皮质骨无明显差异(图4),皮质骨体积骨密度也无明显差异(表5)。

表4 生长期大鼠股骨micro-CT扫描松质骨量化指标分析结果Table 4 Analysis results of quantitative indicators of cancellous bone in micro-CT scans of rat femurs in the growing period n=6)

表5 大鼠股骨体积Table 5 BMD of rat femoral volume

注:A.Control组,B.CT-9组,C.CT-18组;黄色部位为松质骨分析区域。Note:A.the Control group, B. the CT-9 group, C. the CT-18 group. The yellow area is the analysis area of cancellous bone.图2 大鼠股骨micro-CT最大剖面图Fig.2 The largest micro-CT section of the rat femur

图3 大鼠股骨micro-CT骨小梁三维立体图Fig.3 Three-dimensional stereoscopic view of trabecular bone of rat femur by micro-CT

图4 大鼠股骨micro-CT皮质骨三维立体图Fig.4 Three-dimensional view of rat femur micro-CT cortical bone

3 讨论

骨质疏松是一种悄悄发生的疾病,通常在发生第一次骨折前并不会有明显的症状,一旦骨折发生就会给患者带来严重的伤害,更有甚者会因此死亡[9]。OP的预防主要有两种方法:增加峰值骨量和减少骨丢失速率,而峰值骨量(peak bone mass, PBM)是骨发育过程中所能达到的最大骨量,是骨骼坚硬程度和骨矿化水平最高的时期[10]。有研究表明,PBM每提高10%,骨质疏松性骨折的发生风险就降低50%[11],因此借助药物提高幼龄期的PBM,是预防OP的一种有效手段。由于骨组织的健康水平由骨强度决定,所以提高峰值骨量预防骨质疏松的前提是加强骨强度。骨强度由骨密度和骨质量共同决定[11]。骨密度可通过双能X线骨密度仪检测,是诊断OP的金标准[12],而骨质量包括骨生物力学性能和骨显微结构两部分内容。本实验主要围绕骨强度相关指标评价了CT作为抗骨质疏松药物的潜在价值。

实验结果显示,9、18 mg/kg CT均可以提高生长期大鼠全身BMD,对于离体的股骨和椎骨这些主要承重骨的骨密度也有提升作用;micro-CT结果也表明,CT可以明显改善生长期大鼠的股骨骨微观结构,使骨量增加;骨生物力学与抗骨折能力直接相关,本实验中的骨生物力学检测结果也表明,18 mg/kg CT可以提高生长期大鼠股骨的最大载荷和弹性模量,提高股骨的抗骨折能力;并且以上所有实验结果均呈现剂量依赖性。

本实验结果表明,CT可以剂量依赖性地提高生长期大鼠的骨强度,提示其有可能通过提高幼龄期的PBM而降低老年骨质疏松的发病率,可以作为先导化合物进行骨质疏松防治药物的开发研究。