高玉海 谢高倩 孙 薇 吴 西 王中琪柏 鑫 魏 朋 王龙飞 陈克明

(1.中国人民解放军联勤保障部队第940医院基础医学实验室,兰州 730050)(2.甘肃省干细胞与基因药物重点实验室,兰州 730050) (3.中国人民解放军西部战区总医院药剂科,成都 610083)

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种常见的全身代谢性骨病,主要表现为骨密度与骨质量的下降,增加了患者发生脆骨性骨折的风险[1]。随着老龄化社会的到来,老年性骨质疏松患者数量急剧上升,是卫生系统所面临的巨大挑战[2]。峰值骨量(peak bone mass,PBM)指人的一生中骨量所达到的最大值,PBM出现在青壮年时期,此后骨量开始逐渐下降[3]。PBM的水平与OP的发生关系密切,提高青年时期PBM能延缓后期骨流失速度,对预防OP的发生具有一定作用。传统中药治疗OP历史悠久,以淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂和地黄为主要成分的仙灵骨葆胶囊作为治疗OP的中药复方,是广大OP患者的选择之一[4]。许多研究表明,仙灵骨葆胶囊能提高OP大鼠骨密度与骨生物力学性能、改善骨微结构,实现对OP大鼠的骨保护作用[5-7]。但灵骨葆胶囊作用于生长期大鼠的研究至今鲜有报道,本研究以生长期大鼠为实验对象,确定灵骨葆胶囊是否具有提高其骨强度的能力,探究灵骨葆胶囊是否具有提高生长期大鼠PBM来预防骨质疏松的潜力,对OP的预防研究具有一定的参考价值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1试剂与仪器:仙灵骨葆胶囊(国药集团同济堂贵州制药有限公司,生产批号:200804);4%多聚甲醛中性组织固定液与HE染液(武汉塞维尔生物科技有限公司);骨钙素(OCN)定量检测试剂盒与抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)定量检测试剂盒(泉州睿信生物科技有限公司);Prodigy型双能X线骨密度仪(GE公司);AG-IS万能台式力学实验机(岛津公司);SkyScan1276型micro CT(Bruker公司)。

1.1.2动物与分组:20只1月龄体质量(130±10)g的SPF级SD雌性大鼠购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,按照随机数字表法分为对照组和仙灵骨葆组,每组10只。饲养于联勤保障部队第940医院基础医学实验室SPF级动物实验中心,许可证编号【SYXK(军)2017-0047】,实验期间饮水自由,不限制进食。仙灵骨葆组每天给予378 mg/kg的仙灵骨葆灌胃给药,对照组每天给予等体积蒸馏水。实验期间每周测1次大鼠体质量,每两周测一次全身骨密度,待给药6周组别间出现统计学差异时安乐死所有大鼠并开展后续实验。

1.2 方法

1.2.1脏器病理学分析:处死大鼠后迅速剥离心脏、肝、脾、肺和肾,清除周围黏附组织后保存于10%多聚甲醛固定液中。石蜡包埋后切片再经HE染色,显微镜下观察有无病理学改变。

1.2.2骨密度检测:将大鼠麻醉后,放于双能X线骨密度仪上测量全身骨密度。给药6周安乐死大鼠后,取出左侧股骨和椎骨剥离周围多余肌肉,方向统一地摆放于双能X线骨密度仪上测量离体骨密度。测量结束后将椎骨用浸润0.9%氯化钠溶液的纱布包裹保存于-20 ℃冰箱内。

1.2.3生物力学检测:处死大鼠后,剥离右侧股骨用纱布擦去多余组织后置于AG-IS万能台式力学实验机上,在跨距为15 mm、加载速度为2 mm/min的条件下进行三点弯曲实验;从冰箱中取出用纱布包裹的椎骨,剪取第5腰椎,将其修剪为上下平整的圆柱体,立于AG-IS万能台式力学实验机上,在加载速度为2 mm/min的条件下进行压缩实验。

1.2.4Micro CT分析:安乐死大鼠后剥离左侧胫骨,存放于4%多聚甲醛中性组织固定液中。进行micro CT分析时,将胫骨取出擦拭干净周围液体后,用纸巾包裹后置于micro CT实验机中。在电流200 μA、电压85 kV、扫描分辨率为10 μm的条件下进行扫描分析,并通过三维重建软件NRecon进行重建得到最大剖面图与骨形态量化指标。

1.2.5血清生化指标检测:待大鼠麻醉成功后,采用腹主动脉法收集血液,静置1 h后4 000 r/min离心15 min,吸取上清冻存于-80 ℃冰箱。进行血清生化指标检测时,将血清与试剂盒提前放于室温自然解冻,严格按照说明书利用酶联免疫吸附法检测骨形成指标骨钙素(osteocalcin,OCN)与骨吸收指标抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase-5b,TRACP-5b)含量,单位为ng/mL。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 仙灵骨葆对大鼠体质量和脏器的影响

如图1所示,实验期间两组大鼠体质量都呈上升趋势,组别间无统计学差异(P>0.05)。6周后剥离出新鲜的心脏、肝、脾、肺和肾,经肉眼观察并无发现明显形态与色泽上的改变。显微镜下观察各脏器的病理切片,并未发现明显病变,见图2。

图1 大鼠体质量变化情况Fig.1 Change in body mass of

图2 主要脏器组织病理学检查结果(标尺=100 μm)Fig.2 Histopathological examination results of main organs(scale bar=100 μm)

2.2 仙灵骨葆对大鼠骨密度的影响

给药第2周和第4周时,组别间全身骨密度无统计学差异(P>0.05),第6周时仙灵骨葆组全身骨密度与对照组相比有显著上升(P<0.05),股骨骨密度和椎骨骨密度也都显著高于对照组(P<0.05),见图3,4。

注:与对照组相比较,*P<0.05。Note: Compared with the control group,*P<0.05.图3 大鼠全身骨密度检测结果Fig.3 Bone mineral density test results of

注:与对照组比较,*P<0.05。Note: Compared with the control group,*P<0.05.图4 大鼠离体骨密度检测结果Fig.4 In vitro bone mineral density

2.3 仙灵骨葆对大鼠生物力学性能的影响

股骨三点弯曲实验结果显示:与对照组相比,仙灵骨葆组最大载荷和屈服强度显著提高(P<0.05),弹性模量也有所提高(表1);椎骨压缩实验结果显示:仙灵骨葆组最大载荷相比于对照组有显著提高(P<0.05),弹性模量也有明显提高(表2)。

表1 股骨三点弯曲实验结果Table 1 Results of three-point bending test of

表2 椎骨压缩实验结果Table 2 Compression test results of

2.4 仙灵骨葆对大鼠micro CT扫描结果的影响

如图5所示,与对照组相比,仙灵骨葆组胫骨内骨小梁更加密集,且连续性与延展性更好。量化结果显示,仙灵骨葆组骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁数显著高于对照组(P<0.05),骨小梁分离度显著低于对照组(P<0.05)(表3)。

表3 胫骨micro CT量化指标比较Table 3 Comparison of quantitative indexes of micro CT in

图5 胫骨micro CT成像分析最大剖面图Fig.5 Maximum section of micro CT imaging analysis of tibia

2.5 仙灵骨葆对大鼠血清生化指标的影响

如图6所示,仙灵骨葆组血清OCN含量高于对照组(P<0.01),血清TRACP-5b含量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。

注:与对照组相比较,*P<0.01。Note: Compared with the control group,*P<0.01.图6 血清OCN含量和血清TRACP-5b含量Fig.6 The content of OCN and TRACP-5b

3 讨论

仙灵骨葆胶囊为纯中药制剂,是国家食品药品监督管理总局认证的非处方传统中药,临床上常常用于骨质疏松、骨折和股骨头坏死等的治疗[8-10]。大量动物实验结果显示,仙灵骨葆胶囊能缓解OP大鼠的骨流失情况,改善骨密度与骨质量,实现对OP大鼠骨强度的保护[5-7]。但仙灵骨葆胶囊作用于生长期大鼠的相关研究尚无报道。本实验以生长期大鼠为实验对象,探究仙灵骨葆胶囊是否能提高生长期大鼠的骨强度,推测其是否具有提高峰值骨量来预防OP的潜力。

骨组织的健康水平由骨强度决定,因此提高峰值骨量预防骨质疏松的前提是加强骨骼骨强度。骨密度和骨质量共同影响着骨强度,决定了骨骼的健康[11]。骨密度检测能预测骨折的发生风险,骨密度值是诊断OP的金标准[12]。骨密度结果显示,在仙灵骨葆的作用下,全身骨密度、股骨骨密度与椎骨骨密度均有明显提高,说明仙灵骨葆能有效增高生长期大鼠骨密度。骨生物力学指外界力学刺激下骨的生物学效应,反映了骨骼的强度、韧性及抗骨折能力,是评价骨质量的重要指标[13]。股骨三点弯曲实验结果与椎骨压缩实验结果表明,仙灵骨葆能优化生长期大鼠生物力学性能,从提高骨骼硬度、韧性及承受力等方面提高生长期大鼠的骨质量。Micro CT分析得到的最大剖面图直观的体现了骨质量好坏,本次实验中仙灵骨葆明显优化了骨微结构,增加了骨小梁的数量、密度以及厚度,量化结果呈现相同结果。提示仙灵骨葆能从优化骨骼微观结构的角度提高生长期大鼠骨质量。血清生化指标直接体现了骨代谢情况,OCN作为公认的骨形成指标代表了成骨细胞的活性,TRACP-5b作为骨吸收指标反映了破骨细胞活性[14]。本实验血清检测结果显示,仙灵骨葆能提高OCN含量的同时降低TRACP-5b含量,说明仙灵骨葆能从改变骨转化率的角度提高生长期大鼠骨质量。

综上所述,骨密度和骨质量的共同提高表明了仙灵骨葆对生长期大鼠骨强度的提高作用,且仙灵骨葆可能通过抑制骨吸收与促进骨形成来提高骨强度。提示仙灵骨葆具有提高生长期大鼠峰值骨量来预防OP的潜力。本研究从预防骨质疏松的角度为广大学者提供了新思路,但其“应用价值如何?与现有预防OP的天然药物或化合物相比有何优势?”等问题都有待进一步研究。