田贻婷 孟盼盼 蔡 楠 谭宏强 张朋朋 马慧萍

(1.中国人民解放军联勤保障部队第940医院药剂科全军高原医学实验室,兰州 730050)(2.甘肃中医药大学药学院,兰州 730000)

我国海拔3 000 m以上的高原地区约占国土面积的1/6,主要集中在青海、新疆和西藏地区[1],随着西部大开发的实施,越来越多的高原从业者和旅游者前往高海拔地区。大气压随着海拔高度的增加而下降,空气中的氧气含量也会随之降低,这种低压性缺氧会使机体吸入的氧分压降低,从而大大增加了心肺血管系统的负担[2]。长期生活在平原或低海拔地区的人们急进高海拔地区时,会引起组织氧合作用的变化和心肺呼吸系统的强制性调节,从而导致心脏负荷过重引起代偿性失调,进而导致心脏组织损伤[3]。大量研究表明,除了通过综合锻炼习服、阶梯习服、模拟低氧习服,以及适当的登高策略等方法外,药物干预是快速进驻高原时较为现实的预防措施。

利舒康胶囊为国药准字药品,课题组前期研究发现其对模拟高原缺氧大鼠具有很好的心脏保护作用,机制可能与清除氧自由基、抗自由基损伤有关,但其具体的作用通路尚未阐明[4]。有文献[5]报道,核因子E2相关因子2 /血红素加氧酶1(Nrf2 /HO-1)通路是调节氧化应激的关键通路,在高原缺氧损伤中发挥着重要作用。因此,本实验拟采用大型低压氧舱模拟高原海拔8 000 m缺氧12 h,进一步探讨利舒康胶囊在高原缺氧环境下抗心肌损伤的作用并探究其机制,为利舒康胶囊的深入探究和开发提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:SPF级雄性Wiatar大鼠(180～220 g)60只购于联勤保障部队940医院动物科,生产许可证号【SCXK(京)2016-0006】,实验动物使用许可证号【SYXK(军)2017-0047】,实验动物处理遵守联勤保障部队第940医院实验动物伦理审批,伦理审批号:2021KYLL172。

1.1.2试剂与仪器:Anti-Nrf2抗体、Anti-HO-1抗体、PCNA多克隆抗体(均Abcam公司);β-Actin单克隆抗体(中杉金桥);SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);大型低压氧舱(贵州风雷航空军械有限公司);红景天胶囊(西藏军区红景天研制中心生产,生产批号:140601);利舒康胶囊(青海益欣有限责任公司,生产批号:20181003);多样品组织研磨机(上海净信实业发展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1动物分组及处理:将大鼠随机分为正常对照组、缺氧模型组、阳性药红景天胶囊组(420 mg/kg)以及不同浓度利舒康胶囊组(280、420、560 mg/kg),每组10只,灌胃给药,每天一次。正常对照组和缺氧模型组给予等体积的灭菌注射用水,连续给药7 d。

1.2.2模拟高原低压低氧实验:第7天灌胃给药50 min后,正常对照组大鼠饲养于动物实验设施,其余各组大鼠放入大型低压低氧动物实验舱模拟高原海拔8 000 m缺氧12 h,在舱内自由进食和摄水。结束后将舱内海拔降至3 500 m收集脏器。

1.2.3心肌组织超显微病理结构观察:取心肌组织,并立即投入新鲜固定液(2.5%戊二醛)中固定1周后,取出用锋利刀片切成1 mm的小块。样品送往兰州大学基础医学院电镜室,进行浸透与包埋工作以及电镜观察。

1.2.4Western blot法检测Nrf2和HO-1蛋白表达:将实验大鼠心脏取出,按照配方分别提取胞核和胞质蛋白,用BCA法测定蛋白浓度并确定蛋白上样量,加入上样缓冲液,混匀,沸水煮5 min使蛋白变性。配制10% SDS 聚丙烯酰氨凝胶进行电泳、转膜和抗体孵育。检测核转录因子E2相关因子-2和血红素加氧酶-1蛋白表达。次日使用ECL液进行显影,Image J图像分析软件对条带进行分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 利舒康胶囊对心肌组织超显微结构病理影响

对照组心肌细胞肌丝排列整齐,肌节结构清晰,有较完整的线粒体结构,细胞核和线粒体排列整齐,心肌细胞核大,染色质丰富,可见核仁;缺氧模型组肌节结构不清晰,呈“竹节样”改变,线粒体外膜破坏,明显肿胀,可见大量空泡化线粒体,心肌损伤严重;红景天胶囊组线粒体肿胀明显改善,线粒体丰富,可见少数肌丝断裂,心肌损伤明显减轻;利舒康低剂量组与缺氧模型组相比无明显差异,心肌仍存在明显损伤;利舒康中剂量组与缺氧模型组相比有所改善,但线粒体肿胀明显;利舒康高剂量组与缺氧模型组相比明显改善,肌节结构清晰,心肌细胞肌丝完整,线粒体结构完整,少数线粒体肿胀,心肌细胞超微结构基本接近于对照组(图1)。

图1 各组大鼠超显微结构病理变化(×10 000)Fig.1 Ultramicrostructure pathological changes of rats in each group (×10 000)

2.2 利舒康胶囊对心肌组织Nrf2和HO-1蛋白表达的影响

与对照组相比,缺氧模型组胞质Nrf2蛋白表达显著降低(P<0.01),胞核Nrf2蛋白表达显著升高(P<0.05)。与缺氧模型组相比,红景天胶囊组胞质Nrf2有上升趋势,胞核Nrf2有下降趋势,但无显著性差异(P>0.05),而利舒康胶囊低、中、高剂量组心肌细胞胞质内的Nrf2蛋白的表达量均有不同程度的上升,且利舒康高剂量组具有显著性差异(P<0.05)。利舒康胶囊低、中、高剂量组心肌细胞核内的Nrf2蛋白的表达量均有不同程度的下降,且利舒康高剂量具有显著性差异(P<0.05),见图2。

注:1.对照组;2.缺氧模型组;3. 红景天胶囊组(420 mg/kg);4.利舒康胶囊低剂量组(280 mg/kg);5.利舒康胶囊中剂量组(420 mg/kg);6.利舒康胶囊高剂量组(560 mg/kg);与对照组相比,#P<0.05,##P<0.01;与缺氧模型组相比,*P<0.05。Note: 1. Normal control group; 2. Hypoxia model group; 3. Rhodiola capsule group (420 mg/kg); 4. Lishukang capsule low-dose group (280 mg/kg); 5. Lishukang capsule medium-dose group (420 mg/kg); 6. Lishukang capsule high-dose group (560 mg/kg);Compared with control group,#P<0.05,##P<0.01;Compared with hypoxia model group,*P<0.05.图2 利舒康胶囊对心肌组织Nrf2和HO-1蛋白表达的影响Fig.2 Effect of Lishukang capsule on the expression of Nrf2 and HO-1 protein in myocardial issue

与对照组相比,缺氧模型组HO-1蛋白表达量显著升高(P<0.01)。与缺氧模型组相比,红景天胶囊组HO-1有下降趋势,但无显著性差异(P>0.05)。利舒康胶囊低、中、高剂量组均有不同程度的下降,且中、高剂量组具有显著性差异(P<0.05),见图2。

3 讨论

当机体摄入氧气不足时,心脏便会启动代偿机制,通过血管扩张、加速心率和加大心脏动力,增加单位时间内的血流量,以此来提高机体的摄氧能力[6]。但同时也会加重心脏的负担,长此以往会导致心肌细胞氧化损伤,细胞过度凋亡[7]。此外,高原缺氧诱导的氧化应激是导致机体脏器损伤的主要原因,氧化应激是细胞氧化还原平衡被破坏的状态,即活性氧(ROS)水平超过抗氧化系统的防御能力,而ROS是低压低氧心肌损伤的主要诱因[8]。本实验采用大型低压低氧动物实验舱模拟高原海拔8 000 m缺氧12 h建立大鼠缺氧模型,通过观察大鼠缺氧后心肌组织的超微病理结构变化,结果表明,利舒康胶囊可以减轻缺氧大鼠的心肌组织损伤,缓解线粒体肿胀,细胞核和线粒体排列整齐,且利舒康高剂量组优于红景天胶囊组。

核转录因子E2相关因子2(Nrf2)介导的信号传导是一种主要的内源性细胞防御机制,可抵抗机体氧化应激和神经炎性反应,在氧化应激中发挥重要作用[9]。在机体生理功能正常情况下,Nrf2在细胞中受到Keap1的严格调控,二者形成的复合物可被E3泛素连接酶识别,Keap1有效介导Nrf2的多聚泛素化,导致其通过泛素降解系统所降解,呈低活性状态。在氧化应激条件下,Nrf2和Keap1发生解偶联,导致蛋白质Keap1/Nrf2复合物的构象变化,此时过量的Nrf2易位至细胞核,从而抑制缺氧引起的心肌细胞凋亡[10-11]。另有研究表明,Nrf2下游基因血红素加氧酶-1(HO-1)具有保护身体免受氧化损伤,有助于细胞和组织抗炎活性的作用[12]。研究表明,Nrf2/HO-1信号通路的激活可有效防治高原缺氧诱导的氧化应激损伤[13-14]。实验结果表明,与缺氧模型组相比,阳性药红景天胶囊组心肌细胞胞质内Nrf2、HO-1表达明显减少,胞核内Nrf2表达明显升高,但无显著性差异;利舒康低、中、高剂量组心肌细胞胞质内Nrf2、HO-1有不同程度的下降,胞核内Nrf2有不同程度的上升,且高剂量组具有显著性差异。因此我们推测,利舒康胶囊保护心肌组织免受缺氧损伤的机制可能与调节Nrf2/HO-1途径相关蛋白的表达有关,在缺氧条件下,经给药后,促进了Nrf2的活化和入核。使其下游信号分子HO-1表达增加,进而通过清除机体内多余的自由基和ROS来抑制缺氧条件下机体的炎性反应,减轻缺氧引起的心肌损伤。

综上所述,利舒康胶囊可以减轻缺氧条件下心肌损伤,其机制可能是激活Nrf2/HO-1信号通路,进而清除机体内多余的自由基和ROS积累,从而发挥保护心肌组织的作用。