侯雪峰 高玉海 柏 鑫 郭建魁 任 莉 吴思敏 陈克明

(1.中国人民解放军联勤保障部队第940医院,兰州 730050)(2.甘肃中医药大学,兰州 730000)

创伤性及应力性骨折等是骨科常见疾病[1],愈合过程复杂且漫长,在研究骨折愈合过程中的骨转换和骨修复作用以及促进骨折愈合的相关研究有着广阔的发展前景。近年来,国内外学者对股骨骨折模型进行了诸多探索,Bonnarens等[2]在研究中使用闭合性骨折造模仪建立了小鼠的闭合性骨折模型。此后多数闭合性骨折模型都基于此对骨折造模仪进行优化改良,以达到精简准确的目的[3-5]。而开放性股骨骨折模型的建立需要通过手术暴露股骨干,通过圆锯、摆锯等进行切割后,再使用克氏针进行髓内固定,进而建立股骨骨折模型。而对于髓内针直径的选择,国内外研究结果不一,相关研究指出,克氏针进行髓内固定时,其直径占股骨内径的85%最为适宜[6]。鉴于目前造模方式方法较多,本研究根据前人研究基础对大鼠股骨骨折模型进行了诸多探索,包括复制闭合性骨折模型,探讨不同型号克氏针内固定对骨折断端的稳定性,以及对大鼠股骨开放性截骨模型进行优化改良,现通过对本课题组既往研究中采取不同方式方法建立的大鼠股骨骨折模型进行比较研究,客观评价各种方法建立大鼠股骨骨折模型的稳定性及适用性,以期为骨折研究提供可靠的造模方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:70只SPF级雄性Wistar大鼠,体质量180～200 g,购自兰州大学实验动物中心【SCXK(甘)2018-0002】,饲养于中国人民解放军联勤保障部队第940医院实验动物中心【SYXK(军)2017-0047】,室温22～26 ℃,相对湿度40%～70%,使用通用型塑胶笼具饲养,每笼饲养密度不超过10只,大鼠自由摄食饮水,所有操作均符合中国人民解放军联勤保障部队第940医院医学伦理委员会科研伦理相关要求,伦理审批号:2020KYLL128。整体实验的研究方法及过程均符合3R原则。

1.1.2主要仪器与试剂:Ysio全自动DR双板摄影系统(西门子),钛合金克氏针(张家港市华阳医疗器械厂),自制骨折造模仪、骨科钻(上海紫霭医疗器械有限公司),可吸收性外科缝线(上海浦东金环医疗用品股份有限公司),注射用青霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)、碘伏皮肤消毒液(上海利康消毒高科技有限公司)、75%医用乙醇(山东利尔康医疗科技股份有限公司)、0.9%氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1实验动物分组:实验动物根据比较需要将其分为闭合性骨折模型组和开放性骨折模型组,其中闭合性模型组中根据砝码下落高度分为22 cm组(砝码下落高度为22 cm)、26 cm组(砝码下落高度为26 cm)、30 cm组(砝码下落高度为30 cm),开放性骨折模型组根据克氏针型号不同分为0.8 mm组(使用0.8 mm钛合金克氏针内固定)、1.0 mm组(使用1.0 mm钛合金克氏针内固定)、1.2 mm组(使用1.2 mm钛合金克氏针内固定),又依据固定方式不同分为单纯克氏针固定组与克氏针加线固定组。

1.2.2闭合性大鼠股骨线性骨折模型的建立:各组大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)进行麻醉,麻醉后大鼠右侧卧位固定,手术区备皮消毒,在膝关节外侧做一纵行1 cm切口,暴露股骨远端和股四头肌肌腱,将股四头肌肌腱拨向内侧,沿股四头肌肌腱做一纵行0.3～0.5 cm切口,充分暴露股骨内外髁间沟。将0.8 mm克氏针于股骨内外髁间沟出,穿进髓腔并从梨状肌窝处穿出。然后将此处皮肤切开0.5 cm切口,将克氏针折弯,剪掉膝关节处多余的克氏针,闭合伤口。将大鼠置于骨折造模仪冲撞台上,下肢垂直于砧座,使500 g砝码分别从22、26、30 cm高度下落,使术侧股骨骨折(图1)。

图1 闭合性骨折模型造模仪器及操作过程Fig.1 Instrument and operation procedure for modeling closed fracture

1.2.3开放性大鼠股骨线性骨折模型的建立:大鼠禁食24 h,麻醉后,术侧区域备皮消毒,在股骨外侧做一长1.5～2 cm左右的切口。钝性分离黏膜、肌肉,暴露股骨中段,单纯克氏针固定组仅使用1.2 mm克氏针进行髓内固定,克氏针加线固定组除使用1.2 mm克氏针进行髓内固定外,再使用3-0可吸收缝合线对骨折两断端进行牵拉固定。术后,使用0.9%氯化钠溶液将伤口处冲洗干净,缝合肌肉和皮肤。肌肉注射青霉素,10万单位/只。术后连续注射3 d,防止感染。大鼠开放性股骨骨折模型建模成功的标准:骨折类型为股骨中段横断型骨折或短斜形骨折;骨折断裂间隙≤0.5 mm;术后骨折对位良好,无移位,无感染及其他并发症(图2)。

图2 开放性大鼠股骨骨折模型制作过程Fig.2 The process of modeling open femoral fracture in rats

1.2.4X线检查:模型建立后立即对各组大鼠拍摄X线,观察是否符合骨折造模标准。每2周进行一次X线检查,检查时先麻醉大鼠,俯卧位置于X线机下进行拍摄,拍摄条件50～55 kV,5～8 mA。通过X线片观察骨折类型及各组大鼠的骨痂生长情况,并根据骨痂评分标准对大鼠的骨痂生长情况进行评分。断端未见骨痂为Ⅰ级。断端边缘模糊,少见骨痂为Ⅱ级。断处边缘进一步模糊,骨痂量增多但未达到将缺损填满为Ⅲ级。断处边缘已完全消失,缺损被骨痂填满为Ⅳ级。X线Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级分别记为0、1、2、3分并且计算。

1.2.5HE染色观察骨折断端病理学改变:术后8周,依据随机化原则,分别从单纯克氏针固定组与克氏针加线固定组中各抓取3只大鼠,脱颈处死,迅速取出术侧股骨,并固定于4%多聚甲醛溶液中24 h,随后将股骨置于10%EDTA溶液中进行脱钙处理,每周更换脱钙液1次,8周后进行石蜡包埋、切片并染色,在显微镜下观察组织病理学变化。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 X线片比较结果

2.1.1闭合性骨折模型X线结果:X线结果显示,砝码下落高度30 cm造模成功率为17%,砝码下落高度26 cm造模成功率为50%,砝码下落高度22 cm造模成功率为33%。X线片显示该造模方式制造的大鼠股骨骨折模型其骨折类型复杂多样(图3)。结果提示该造模方式建立闭合性大鼠股骨线性骨折模型成功率较低,总体造模成功率未达到理想状态。

图3 大鼠股骨闭合性骨折线片,砝码500 g,下落高度分别为30、26、22 cm Fig.3 X-ray images of closed femoral fractures in rats were taken with weights of 500 g and falling heights of 30, 26 and 22 cm, respectively

2.1.2不同型号克氏针内固定的开放性骨折模型X线结果比较:X线结果显示,随着克氏针直径的升高,其固定效果也更好,实验结果表明1.2 mm克氏针较其他两种型号固定效果更好,并且从X线片观察到各组骨痂生长情况未表现出明显差异(图4)。

图4 不同型号克氏针内固定的开放性骨折模型X线片Fig.4 X-ray images of open fracture models with different types of Kirschner wire internal fixation

2.1.3单纯克氏针固定组与克氏针加线固定组X线结果比较:X线结果显示,单纯克氏针固定组有1只大鼠在造模后第2周克氏针脱出,4只大鼠在造模后第6周时克氏针均有不同程度脱出,其中有2只大鼠的克氏针完全脱出,造成骨折断端严重移位,最终符合实验标准占比为67%。克氏针加线固定组有1只大鼠在造模后第4周克氏针脱出,骨折断端成交角移位,最终符合敷衍标准的占比为93%。

2.1.4单纯克氏针固定组与克氏针加线固定组骨痂评分结果:比较两组造模2周和4周后骨痂X线评分情况,结果显示克氏针加线固定组的评分明显优于单纯克氏针固定组(图5,6)。

图5 单纯克氏针固定与克氏针加线固定的开放性骨折模型X线片Fig.5 X-ray images of open fracture models with Kirschner Wire fixation and Kirschner wire-sewing threads fixation

注:克氏针加线固定组与单纯克氏针固定组的骨痂评分比较,*P<0.05。Note:Comparison of poroma score between Kirschner Wire fixation and Kirschner wire-sewing threads fixation,*P<0.05.图6 克氏针加线固定组与单纯克氏针固定组的骨痂评分比较Fig.6 Comparison of poroma score between Kirschner wire-sewing threads fixation and Kirschner Wire fixation

2.2 单纯克氏针固定组与克氏针加线固定组组织形态学比较

HE染色处理结果显示,治疗8周后克氏针加线固定组已经形成骨性连接,骨痂塑性基本完全,骨折断端以成熟的骨细胞为主,并有少量尚未钙化完全的骨细胞。而单纯克氏针固定组骨桥连结仍以软骨及纤维连结为主,两骨折断端均形成了一定的软骨,构成假关节样结构。结果提示克氏针加线固定组其固定稳定,骨折愈合良好且未见可吸收线对其产生不良影响(图7)。

注:克氏针加线组可见骨折断端以已钙化的骨细胞为主,单纯克氏针固定组以半透明状的软骨为主。Note:In the group with Kirschner wire and suture, the fracture ends predominantly showed calcified bone cells. In the group with only Kirschner wire fixation, the main feature was translucent cartilage.图7 克氏针加线固定与单纯克氏针固定建模8周后的股骨骨折断端的HE染色切片Fig.7 HE staining images of broken end of a femur fracture between Kirschner Wire fixation and Kirschner wire-sewing threads fixation after 8 weeks of modeling

3 讨论

骨折是人类最常见的大器官创伤[7],在动态愈合过程中涉及诸多复杂机制。近年来,随着国内外对于骨折、骨不连以及骨延迟愈合的研究日益增多,建立一种理想可靠的骨折动物模型成为了首要问题。目前骨折模型多集中于大鼠、小鼠的股骨骨折和胫骨骨折模型,根据建模方法的不同将其分为闭合性骨折模型和开放性骨折模型。

目前国内外研究者多因闭合性骨折模型对周围皮肤、软组织等损伤较小而采用闭合性骨折模型[5,8-9]。本研究参考Bonnarens等[2]设计的骨折造模仪,结果显示,500 g砝码分别从22、26、30 cm高度下落其造模成功率均不理想,结果提示虽然闭合性骨折模型其损伤机制更贴合于实际,但由于实验动物之间存在较大的个体差异,同时,大鼠在砧座上的置放位置、角度等均会影响股骨的应力,故可能存在的问题是骨折类型多样,可重复性差,很难保证实验动物的同质性。另外,骨折造模仪的精密程度对骨折模型的影响也较为巨大,骨折造模仪需要人工制作,复制较为困难,对技术要求较高,需要多次实验、改进,人力物力耗费较大。

开放性骨折模型,创伤较大,对软组织损伤也较为严重,甚至可能伴有一定的感染风险,但是由于其可控性好,仍然被诸多研究者使用[10-11]。另外,无论是闭合性骨折模型还是开放性骨折模型都需要采取一定的固定方法,正确固定结构的应用对骨折的愈合和长期稳定性至关重要。国内外相关研究中多数采用髓内针进行固定,研究表明虽然髓内针会破坏骨髓,并干扰髓内血液循环,但并不会阻止骨折修复过程[2]。但是髓内针的粗细会影响骨折断端的稳定性,其对骨髓破坏的程度也不同,这些因素均会改变骨折愈合的速度。本研究基于参考文献[12]的建模方法,并进行优化改良,分别采用0.8、1.0、1.2 mm的克氏针进行髓内固定,结果显示1.2 mm的固定效果优于其他两组。此外,在实验过程中发现,虽然髓内针内固定对股骨断端进行轴向固定,控制了横向移位,但是由于克氏针表面光滑,很难控制纵向移位,以及由于大鼠活动造成的克氏针直接脱出,本课题组又对开放性骨折模型造模方法进行改进。结果显示,克氏针加线固定组的稳定性明显提高,骨痂评分优于单纯克氏针固定组,提示其愈合质量更好,两组的骨组织病理学也显示出在造模8周后克氏针加线固定组基本愈合,而单纯克氏针固定组骨折断端仍然以纤维软骨的形式存在,可能由于断端活动,已经形成“假关节”样结构。

总之,本研究通过综合对比本课题组既往实验中的不同砝码高度下落造成的大鼠股骨闭合性骨折模型、采用不同型号克氏针髓内固定的开放性骨折,以及通过比较单纯克氏针固定与克氏针加线固定的开放性骨折模型发现,闭合性骨折模型骨折类型不确定,重复性较差,而在开放性骨折中2 mm克氏针比0.8、1.0 mm的克氏针固定效果好,进一步研究发现采用1.2 mm克氏针同时加可吸收线对两骨折断端进行牵拉固定效果十分理想,且对骨折的愈合过程未产生不良影响。综上所述,通过对现有大鼠股骨骨折建模方法进行改良,确定了1.2 mm克氏针加线固定的开放性大鼠股骨线性骨折模型是一种理想的实验模型,稳定性好,可重复性高,操作难易程度适中,同时可保证实验对象的同质性和均一性。