王红义 冯小明 李渊明 肖 攀 陆 璐 申栋帅 牛廷献 张 萍

(1.中国人民解放军联勤保障部队第940医院基础医学实验室,兰州 730050)(2.中国农业科学院兰州兽医研究所,兰州 730046) (3.甘肃省中心医院神经内科,兰州 730070)(4.中国人民解放军联勤保障部队第940医院检验科,兰州 730050)

多脏器功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)指在重度创伤性感染、手术应激、大面积烧伤等病理因素的刺激下,多个重要器官24 h以内相继发生功能性障碍或衰竭,最终引起机体内环境平衡紊乱的一类疾病[1]。MODS具有发病急、进展快及病理机制复杂等特点,涉及免疫体系失衡、过氧化物及内源性血管活性介质的异常释放等病理特征[2]。参附注射液是临床用之有效的中药制剂,主要有效成分为乌头碱及人参皂苷[3],药理学研究显示[4],其活性成分能够调节神经内分泌免疫网络系统失衡,提高机体免疫功能。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein, HMGB1)通过加速调节性T细胞(Treg cell)的凋亡速率和抑制单核细胞炎性细胞因子的分泌而阻断炎性反应与凝血障碍的恶性循环,而中药血必净主要是通过抑制HMGB1而达到改善机体炎性反应、免疫和凝血功能,防止脓毒症的发生发展[5-6]。本研究以高海拔地区MODS绵羊为模型,探讨参附注射液联合中药血必净对MODS血浆中血清降钙素原(plasma calcitonin, PCT)和MHC-II类分子(human leukocyte antigen DR, HLA-DR)的影响,为参附注射液联合中药血必净的临床用药提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF级1岁龄绵羊24只,购自兰州雄振羊业养殖厂,雌雄各半,体质量5～7 kg,全部饲养于中国人民解放军联勤保障部队第940医院实验动物中心大动物房,设施使用许可证号【SYXK(军)2009-022】,温度(20±2)℃、湿度(50±5)%。麻醉药物为速眠新Ⅱ号(军事医学科学院军事兽医研究所),内毒素(LPS,血清型号为0127:B8,批号为64H4010,Sigma公司),参附注射液(雅安三九药业有限公司,批号 991201),血必净注射液(天津红日药业股份有限公司,国药准字Z20040033,规格:10 mL×5支/盒),化学发光分析仪(Brahms公司,Lumat LB 9507)。

1.2 方法

1.2.1模型建立与分组处理:方法参照文献[3]制作MODS模型,除正常组外,其余18只绵羊均用速眠新Ⅱ号(1.5 mL/kg)肌内注射麻醉后经前肢桡静脉泵入LPS(6 μg/kg,30 min)制作MODS模型,并随机分为模型组、观察1组及观察2组,每组6只。观察1组在常规综合治疗基础上应用参附注射液100 mL,微量泵以 20 mL/h 连续静脉泵入,1次/日。观察2组在常规综合治疗基础上应用参附注射液联合静脉滴注(Xuebijing,XBJ)(2 mL/kg),1次/日,观察1组和观察2组皆以1周为1疗程,共计1疗程。本文动物实验过程均严格按照“3R”原则设计和操作,方案通过中国人民解放军联勤保障部队第940医院科研伦理委员会审查,伦理审批号:2022KYLL019。

1.2.2检测指标与方法

1.2.2.1 PCT水平检测:采取静脉血后离心取血清,半定量胶体金免疫结合法测定血清PCT水平。

1.2.2.2 HLA-DR水平检测:静脉血EDTA 抗凝,制备单核细胞悬液,测定细胞浓度,向反应管中加入50 μL细胞悬液,再加入HLA-DR 单克隆抗体(北京博尔迈生物有限公司)10 μL,冰浴避光反应30～45 min,再经过洗涤、固定后悬浮待测,使用FACScan 流式细胞仪(北京御仪都环境科技有限公司)检测阳性细胞率。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 模型建立体征表现及死亡率

模型组绵羊静脉泵入LPS 2 h后,出现呼吸困难并且频率加快,心率快而不齐,心律失常、3 h后腹胀,尿频,不能站立,运动障碍,12和16 h分别有2只羊因呼吸窘迫、心衰而死亡。观察1组和观察2组较模型组在注入LPS后也出现不同程度的呼吸困难并且频率加快、心律失常、腹胀、尿频,所有羊均出现不能站立,运动障碍等问题。其中观察1组和观察2组分别在20和24 h有1只羊死亡,其他羊在24 h后其体征表现较模型组明显减轻。结果表明,参附注射液和联合血必净能明显改善LPS诱导的动物体征表现、降低MODS死亡率。

2.2 MODS绵羊血浆PCT水平检测比较

MODS绵羊建模成功后,模型组、观察1组及观察2组血浆PCT比较,F=0.430,P>0.05,差异无统计学意义,但与正常组比较血浆PCT水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗0.5、1、2、3、7 d后模型组与观察1组比较,血浆PCT水平明显降低(P<0.05),差异有统计学意义;与观察1组比较,观察2组PCT下降水平更为显著,尤其是治疗12 h后,差异具有显著统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组MODS绵羊血浆 PCT 水平检测比较Table 1 Comparison of plasma PCT levels in MODS sheep among different groups (EU/mL,

表2 各组MODS绵羊血浆HLA-DR水平比较Table 2 Comparison of plasma HLA-DR levels in MODS sheep among different groups (EU/mL,

2.3 MODS绵羊血浆HLA-DR水平检测比较

MODS绵羊建模成功后,模型组、观察1组及观察2组血浆HLA-DR比较,F=1.410,P>0.05,差异无统计学意义(P>0.05),但与正常组比,较血浆HLA-DR水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、观察1组及观察2组治疗后12 h, 血浆HLA-DR水平检测,差异无统计学意义(P>0.05),但治疗后1、2、3、7 d,模型组、观察1组和观察2组血浆HLA-DR水平均依次升高,组间多重比较差异均有统计学意义(P<0.05);与观察1组比较,观察2组0.5、1、2、3、7 d血浆HLA-DR水平依次升高(P<0.05),见表 2。

3 讨论

MODS是由体内TNF-α、IL-6、IL-8等炎性因子介导的全身自我破坏性炎性反应过程,是众多致命性感染疾病的终末阶段[8]。当机体受到严重感染(创伤、烧伤、胰腺炎、休克)时机体HMGB1含量升高,广泛参与到T细胞增殖分化、氧化应激及炎性反应等病理生理过程中,促进炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6等广泛浸润,血管内皮细胞、中性粒细胞被激活并释放大量介质作用于全身重要器官诱发SIRS,而免疫系统由于延续效应对持续升高的细胞因子处于麻痹和抵抗状态,机体免疫应答受到抑制[9-10]。

参附注射液是从传统中药人参和附子中提取有效成分而制成的,具有“回阳救逆、益气固脱”的作用,人参为大补元气、培固后天之品,附子可温壮元阳,回阳固脱,两药相配共达救逆回阳、温阳益气之功效[11]。有关研究[12-14]表明,参附注射液能降低MODS模型大鼠血浆HMGB1表达,抑制T淋巴细胞分化速率及降低花生四烯酸和肌酸水平,从而有效调节了机体血管内皮增殖及血液动力学变化,纠正并预防脏器功能衰竭的发生。本研究中观察1组MODS模型组绵羊治疗后0.5、1、2、3、7 d后血浆PCT水平明显降低、尤其是治疗后12 h变化最为明显(P<0.01),提示参附注射液对MODS模型绵羊的治疗效果明显。血必净注射液是由王今达教授以王清任活血化瘀名方血府逐瘀汤组方为基础,并辨证加减化裁而研制的中药静脉制剂,其中有效成分为红花、赤芍、丹参等提取物,包括红花黄色素A、川芎嗪、阿魏酸等,该注射剂具有活血化瘀、清热解毒的功效,可抑制MODS炎性介质的弥漫性浸润,内毒素的释放及清除体内氧自由基而保护血管内皮细胞[15-16]。血必净通过抑制T淋巴细胞及中性粒细胞在肺内集聚而释放炎性介质、抑制肺上皮细胞过度活化而导致肺功能障碍,减少氧自由基释放而对急性肺损伤有一定的保护作用[17]。

PCT为降钙素蛋白质的前体,易被LPS、病原菌等受体识别,介导全身炎性反应,是检测机体炎性感染的重要检测指标[18]。生理情况下机体血清中 PCT含量极低,而LPS诱导的MODS绵羊通过激活TLR信号通路释放多种细胞因子,广泛浸润导致局部炎性反应加剧,而且PCT 较其他细胞因子产生及释放更早。国内研究指出对于感染性休克等重度感染疾病,PCT诊断的特异性要优于肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素IL-6 等指标[19]。在本研究中MODS绵羊建模成功后,模型组、观察1组、观察2组血浆PCT比较,治疗0.5、1、2、3、7 d后模型组与观察1组比较,血浆PCT水平明显降低(P<0.05),与观察1组比较,观察2组下降水平更为明显,尤其是治疗12 h后(P<0.01),差异具有统计学意义。因此参附注射液联合血必净可以抑制和控制过强的全身炎性反应,保持内环境稳态从而防治多脏器功能障碍综合征,重建免疫平衡。HLA-DR是体内表达水平最高的组织相溶性抗原MHC,MHC类抗原在机体免疫系统中发挥着至关重要的抗原递呈作用,一方面发挥诱导和增强免疫应答的作用,另一方面如果HLA-DR的体内表达水平减少或抗原递呈作用受到阻碍,机体就不能产生有效的免疫应答,从而导致多脏器功能的障碍[20]。与本研究中得出的结论是相一致的,即治疗后24 和48 h,对照组、观察1组和观察2组血浆 HLA-DR水平均依次升高(P<0.05)。

综上所述,单独注射参附注射液或参附注射液和血必净联用均可显著降低血浆PCT水平、升高HLA-DR水平,表现出良好的对高海拔地区内毒素致绵羊多脏器功能障碍综合征的治疗前景。此外,参附注射液和血必净联合注射相比单独注射参附注射液对上述两项指标作用更加显著,说明两药联用是针对高海拔地区内毒素致绵羊多脏器功能障碍综合征的一种更优用药方案,为该综合征的治疗提供新的用药思路。