石志群 李 琳 张 洁 蔡 楠 田贻婷 马慧萍

(1.中国人民解放军联勤保障部队第940医院药剂科全军高原医学实验室,兰州 730050) (2.中国中医科学院 中药研究所,北京 100700)

中枢神经系统对氧非常敏感,高原低压低氧环境会对中枢神经系统造成一定的损伤,严重影响进入高原人群的认知能力,并引发多种严重的病理变化,如大脑麻痹、反应延迟、学习能力与记忆力减退、癫痫,以及失眠头晕情绪改变等多种精神紊乱[1]。海拔5 000 m以上的慢性缺氧会对人脑造成神经性损伤,在返回低海拔区域之后损伤甚至会持续一年以上,即使是急性减压1 h,人的短期记忆也会衰退[2]。

前期实验表明[3],本课题组采用低压低氧动物实验舱模拟高原缺氧环境对小鼠脑组织造成了严重的缺氧损伤,神经元细胞形态发生改变、为脑组织提供能量的线粒体数量大幅度减少,有氧呼吸所依靠的嵴消失,线粒体破裂,还引起脑组织各项生化指标的改变,对脑组织的正常功能造成了一定影响。为进一步研究雪莲黄酮胶囊对急性高原缺氧脑组织的保护能力,本实验选择Morris水迷宫作为评价脑损伤小鼠的学习和记忆能力,并检测线粒体膜电位及复合物活力、缺氧相关基因蛋白的表达情况,从行为学及基因表达方面评价雪莲黄酮胶囊对急性高原病的防治能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:SPF级雄性BALB/c小鼠80只,体质量18～22 g,购自兰州生物制品有限公司,实验动物生产许可证号【SCXK(甘)2017-0001】,实验动物使用许可证号【SYXK(军)2017-0047】,实验动物处理遵守联勤保障部队第940医院审批,实验动物伦理审批号:2015GKJ017。

1.1.2试剂与仪器:乙酰唑胺(武汉远城科技发展有限公司);雪莲黄酮胶囊(中国人民解放军联勤保障部队第940医院);BCA蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所);线粒体膜电位试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);RNAiso Reagent、TaKaRa Prime ScriptTM reagent Kit、PCR扩增试剂盒(均为大连宝生物公司),引物委托宝生物工程公司合成;HIF-1α抗体、VEGF抗体、SOD抗体(均为Abcam公司);Western BrightTM ECL(Advansta公司);DYC-3070型低压低氧动物实验舱(中航工业贵州雷航空军械有限责任公司);SpectraMax i3全自动荧光酶标仪(Molecular Devices公司);HP8453二级管阵列紫外可见分光光度计(惠普公司);蛋白电泳转膜系统(伯乐公司);Morris水迷宫(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1动物分组及处理:取SPF级雄性BALB/c小鼠共80只,饲养适应3 d后随机分成正常组(N)、模型组(M)、乙酰唑胺组(ACZ,250 mg/kg)和雪莲黄酮胶囊组(XLJN,500 mg/kg),每组20只,单次灌胃给药。正常组小鼠不缺氧,其余各组小鼠给药50 min后放入模拟8 000 m海拔环境,维持缺氧9 h,小鼠完成减压后每组随机取10只进行水迷宫训练,剩下的收集脑组织,-80 ℃冰箱冻存,待用。

1.2.2Morris水迷宫实验:将水迷宫分为4个象限,在第二象限放置一平台,进行空间学习训练,并记录小鼠潜伏时间与游泳路径。第6天上午进行定位导航实验,撤离平台,将小鼠面向池壁从原平台的对侧象限入水点放入水中,记录60 s内小鼠的游泳轨迹、总搜索路程、原平台位置穿越次数、原平台象限进入次数。

1.2.3线粒体膜电位的测定:取各组小鼠脑组织0.1 g左右,切碎,加入10倍量分离缓冲液[4],放置在盛有冰水混合物的器皿中充分研磨,使组织匀浆化,3 000 r/min离心2 min,弃沉淀,上清液以12 000 r/min离心,弃去上清,沉淀加入0.25 mmol/L蔗糖得到线粒体重悬液,按说明书操作使用荧光酶标仪进行测量。

1.2.4线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ功能的测定:线粒体呼吸链复合体 Ⅰ 功能测定:NADH + CoQ + H+→ NAD++ CoQH2,测定方法参考文献[4],30 ℃孵育5 min;600 nm连续扫描2 min。线粒体呼吸链复合体 Ⅱ 功能测定:琥珀酸 + CoQ + H+→ 延胡索酸+ CoQH2,测定方法见参考文献[5],30 ℃孵育5 min,600 nm扫描2 min。线粒体呼吸链复合体 Ⅲ 功能测定:CoQH2+ 2 ferricytochrome C→ CoQ + 2 ferrocytochrome C+2 H+,测定方法见参考文献[6],30 ℃孵育5 min,550 nm扫描2 min。

1.2.5RT-PCR测定mRNA表达水平:向缺氧后的小鼠脑组织中加入1 mL RNAiso Plus试剂研磨,加200 μL三氯甲烷,混匀后离心弃上清液,用75%乙醇溶液纯化总RNA沉淀,再次离心弃上清进行反转录,具体步骤参照PrimeScriptTM RT reagent Kit说明书进行。Real-time PCR检测:步骤依照Applied Biosystems公司7300仪器说明进行实验。反应条件如下:两步法PCR扩增,95 ℃预变性30 s;95 ℃反应5 s,60 ℃退火31 s,40个循环。引物及序列见表1。

表1 Real- time RT- PCR引物序列Table 1 Real-time RT-PCR primer sequences

1.2.6蛋白质印迹法测定HIF-1α、VEGF、SOD蛋白的表达:取小鼠脑组织,按照配方提取脑组织蛋白,BCA法对总蛋白浓度进行定量,加入上样缓冲液,混匀,沸水煮5 min使蛋白变性。采用SDS-PAGE进行电泳、转膜和抗体孵育。次日配制ECL发光液,进行显影,用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度值分析。

2 结果

2.1 雪莲黄酮胶囊对低压低氧模型小鼠行为学的影响

2.1.1空间学习结果:与正常组相比,缺氧模型组在第3天训练后,潜伏时间明显延长,游泳路径杂乱无序。与模型组相比,雪莲黄酮胶囊组和乙酰唑胺组均可缩短潜伏时间,且具有显著性差异。潜伏时间变化见表2,游泳路径变化见图1(以第1天和第5天为例)。

图1 雪莲黄酮胶囊对低压低氧模型小鼠水迷宫游泳路径变化的影响Fig.1 Effect of Saussurea flavone capsule on swimming path changes in water maze in low-pressure and hypoxic mice

表2 雪莲黄酮胶囊对低压低氧模型小鼠水迷宫实验潜伏时间的影响Table 2 Effect of Saussurea flavone capsule on latency time of water maze test in low-pressure and hypoxic

2.1.2运动路径与距离的影响:与正常组相比,模型组进入原平台所在象限的次数减少,有效象限中的运动距离百分比缩短(P<0.05)。雪莲黄酮胶囊组小鼠进入有效象限的次数、运动距离百分比均显著高于模型组(P<0.01),且与正常组无显著性差异。乙酰唑胺也可提高小鼠在有效象限的运动百分比,但在次象限的运动距离与模型组相比并无显著差异,如表3所示。

表3 雪莲黄酮胶囊对有效区域运动路径与距离的影响Table 3 Effect of Saussurea flavone capsule on movement path and distance in effective region

2.1.3穿越平台情况的影响:与正常组相比,模型组小鼠进入有效区域次数、穿越平台次数减少(P<0.05)。雪莲黄酮胶囊组有效区域次数、穿越平台次数均显著高于模型组(P<0.05),与正常组无显著性差异,如表4所示。

表4 定位航行实验有效区域进入次数Table 4 Entry times of effective area for

2.2 雪莲黄酮胶囊对低压低氧模型小鼠脑组织线粒体膜电位的影响

与正常组膜电位(0.442±0.027)相比,模型组线粒体膜电位(0.281±0.022)下降,线粒体膜电位去极化程度增强,线粒体膜电位降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,乙酰唑胺组(0.384±0.057)和雪莲黄酮胶囊组(0.407±0.031)的线粒体膜电位上升,具有统计学差异(P<0.01)。

2.3 雪莲黄酮胶囊对低压低氧模型小鼠脑组织线粒体复合物电位的影响

与正常组相比,模型组脑组织线粒体复合物I的活性显著降低,复合物Ⅱ缺氧后无显著变化,复合物Ⅲ活力降低但与正常组相比无显著性差异;与模型组相比,乙酰唑胺与雪莲黄酮胶囊预防给药组的复合物I活性与模型组相比显著提高(P<0.01),乙酰唑胺与雪莲黄酮胶囊预防给药未能使复合物Ⅱ、复合物Ⅲ的活性发生显著变化,如表5所示。

表5 雪莲黄酮胶囊对脑组织线粒体复合物的影响Table 5 Effect of Saussurea flavone capsule on mitochondrial complex in brain

2.4 雪莲黄酮胶囊对低压低氧模型小鼠脑组织缺氧相关mRNA的影响

与正常组相比,缺氧小鼠脑组织HIF-1α、VEGF mRNA表达水平显著提高,SOD mRNA、CAT mRNA水平显著提降低(P<0.01);与缺氧模型组相比,雪莲黄酮胶囊组和乙酰唑胺组脑组织HIF-1α、VEGF mRNA表达水平均有所下降,SOD、CAT mRNA表达水平均有所提高(P<0.01)(表6)。

表6 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织HIF-1α、VEGF、SOD、CAT mRNA的影响Table 6 Effects of Saussurea flavone capsule on HIF-1α,VEGF, SOD, CAT mRNA in myocardial tissue of mice with simulated altitude

2.5 雪莲黄酮胶囊对低压低氧模型小鼠脑组织缺氧相关蛋白含量的影响

与正常组相比,缺氧模型组小鼠脑组织HIF-1α、VEGF含量显著提高,SOD含量显著降低(P<0.01,P<0.05);与缺氧模型组相比,雪莲黄酮胶囊组和乙酰唑胺组小鼠脑组织HIF-1α、VEGF蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05),SOD蛋白表达显著提高(P<0.01)(图2,表7)。

图2 雪莲黄酮胶囊对缺氧小鼠脑组织缺氧相关蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoretic diagram of hypoxic-related protein expression in brain tissues of hypoxic mice induced by Saussurea flavone capsules

表7 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠脑组织缺氧相关蛋白表达量的比较Table 7 Comparison of brain tissues hypoxic-related protein expression levels of Saussurea flavone capsules in mice with simulated altitude

3 讨论

在高原环境下,氧分压随海拔升高而降低,进而形成天然的低压低氧环境。这一独特的环境特点,对于高原值守作业的部队官兵以及工作、生活的人们来说,时常要面临缺氧的风险,影响人们观察、感知、记忆、思维等方面,更严重会造成反应迟缓、记忆困难、注意力下降等,最终造成大脑不可逆性损伤[7]。缺氧条件下,神经元细胞的线粒体数量减少,线粒体膜肿胀、破损,呼吸链电子传递发生障碍,进而酶活性受到抑制,致使ATP合成减少、自由基产生增多,造成神经元坏死或凋亡,从而出现临床认知功能下降[8]。水迷宫行为学表明,模型组小鼠学习能力显著降低,空间记忆力受损,线粒体膜电位去极化程度增强,线粒体膜电位降低,线粒体复合物I活性显著降低,复合物Ⅱ缺氧后无显著变化,复合物Ⅲ活力降低但与正常组相比无显著性差异;而乙酰唑胺或雪莲黄酮胶囊预防给药后,小鼠的学习能力与模型组相比明显提高,线粒体膜电位升高,复合物I活性与模型组相比显著提高,复合物Ⅱ、复合物Ⅲ的活性未发生显著变化,表明雪莲黄酮胶囊可减轻过量自由基造成的损伤,维持ATP酶活性,从而防止高原病的发生,对低压低氧所造成的脑认知损伤具有良好的预防保护作用。

缺氧诱导因子-l(HIF-1)是高度特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子,是专一调节氧稳态的关键介质[11],其作为活性氧受体,感受环境中的低氧程度,同时又对起效应器作用的低氧反应基因的转录具有调控作用[12]。表皮生长因子(VEGF)为HIF-1的下游基因,它的增多使毛细血管通透性增强,水肿加重[13]。通过RT-PCR检测缺氧相关基因,缺氧可造成脑组织HIF-1α、VEGF mRNA表达明显升高,而雪莲黄酮胶囊可使HIF-1α、VEGF mRNA表达降低,说明雪莲黄酮胶囊通过降低小鼠脑对于缺氧的敏感性,延缓组织水肿来抵抗缺氧造成的损伤。SOD与CAT是机体清除自由基的主要酶,是抗缺氧能力的重要指标。缺氧可造成模型组SOD、CAT mRNA表达与蛋白含量降低,而雪莲黄酮胶囊给药后,缺氧小鼠的SOD、CAT mRNA表达、蛋白含量显著提高,证明其能够通过增加缺氧小鼠脑SOD与CAT的含量,提高脑组织的抗氧化能力。

综上所述,雪莲黄酮胶囊对低压性缺氧小鼠所造成的脑认知损伤具有良好的预防保护作用,其保护机制可能与影响HIF-1α、VEGF mRNA的表达、线粒体调节、小鼠组织内部氧平衡、血管生成、提高抗氧化酶含量有关。