张丽华，刘 琪，李 星，王 羽，林 立，何瑞云，姜 洁

（北京市食品检验研究院（北京市食品安全监控和风险评估中心），国家市场监管重点实验室（食品安全重大综合保障关键技术），北京 100094）

利尿剂类药物可增加人尿的排泄量，促使积聚在皮下和腹腔中多余的水分在短时间内大量排出，在临床上可用于治疗液体潴留心力衰竭、高血压以及肾病［1-2］。在动物饲养过程中，利尿剂也可用于治疗奶牛乳房炎，或改善禽蛋蛋白比例，减少动物胴体的含水率等［3］。GB 31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定可以使用的利尿类药仅包括氢氯噻嗪和甘露醇2种［4］，其作用是促进肾脏排尿、降低血压等。由于动物体内的利尿剂残留可通过食物链进入人体，实际使用中存在兽药、饲料中非法使用食品安全国家标准中未规定允许使用的利尿剂类药物，以及保健食品中非法添加氢氯噻嗪等利尿剂类药物的隐患［3，5］。长期食用含有利尿剂类药物的食品，易造成机体代谢紊乱、损害肝肾功能、神经系统等风险［6］，危害人体健康。

目前，国内外关于利尿剂类物质检测方法的研究多集中在动物饲料［3，7］、人体尿液［8-9］及血浆［10-11］，化妆品中利尿剂类物质的检测也有所涉及［12］，我国现行国家标准中规定了化妆品中氯噻酮和螺内酯的检测方法［13-14］。随着对食品中利尿剂类物质关注的提升，近年先后发布了SN/T 5167-2019《出口动物源食品中氢氯噻嗪等10 种利尿剂残留量的测定方法》［15］、GB 31658.25-2022《食品安全国家标准 动物性食品中10 种利尿药残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》［16］。目前利尿剂的检测多使用乙腈、乙酸乙酯、甲醇等作为提取试剂，通过液液萃取、固相萃取柱等方式进行净化，检测方法包括液相色谱法［17-19］、液相色谱-串联质谱法［20-22］、气相色谱-质谱法［23］、光谱法［24-25］等，其中液相色谱、光谱法的灵敏度较低；气相色谱-质谱法需对样品进行衍生，实验步骤较复杂。液相色谱-串联质谱法因具有较好的灵敏度且前处理过程相对简便而得到广泛应用，但涉及的利尿剂种类仅有十几种，且食品基质多以动物肌肉组织、牛奶为主。高分辨质谱可获取母离子及子离子精确质量数，通过保留时间和同位素分布等参数具备更好的定性能力。本文以内标法定量，采用超高效液相色谱-串联高分辨质谱法对动物源性食品中25种利尿剂药物进行同时测定，方法具有较高的灵敏度，可较好地抵消不同样品的基质效应，为食品中利尿剂类物质残留监测提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UltiMate 3000Q-Exactive HF-X 超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（Thermo Fisher公司）；3K30 离心机（德国Sigma 公司）；SONOREX DL 1028H 超声清洗器（德国Bandelin 公司）；N-EVAP 112 氮吹仪（美国Organomation 公司）；VORTEX 3 涡旋混合器（德国IKA 公司）；ACQUITY HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）；Oasis PRiME HLB（6 mL/200 mg，Waters公司）。

托伐普坦、依他尼酸、阿米洛利、丙磺舒、呋塞米、氯噻酮、精磺胺（ACDM）、乙酰唑胺、氯噻嗪、螺内酯、坎利酮、卞氟噻嗪、氨苯蝶啶、苄噻嗪、环噻嗪、甲氯噻嗪、泊利噻嗪、氢氯噻嗪、托拉塞米、环戊噻嗪、依匹噻嗪、甲苯噻嗪、依普利酮、布美他尼、美托拉宗；丙磺舒-D14、呋塞米-D5、氯噻酮-D4、精磺胺-15N2、乙酰唑胺-D5、氯噻嗪-13C15N2、坎利酮-D6、卞氟噻嗪-D5、氨苯喋啶-D5、氢氯噻嗪-13CD2、托伐普坦-D7、依他尼酸-D5、托拉塞米-D7、布美他尼-D5、依普利酮-D3、美托拉宗-D7，购自天津阿尔塔公司，纯度均大于95%。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取利尿剂标准品各10 mg（精确至0.1 mg），置于10 mL小烧杯中，用甲醇溶解，转移至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，配制成质量浓度为0.1 mg/mL的利尿剂标准储备液。氨苯蝶啶及氨苯喋啶-D5标准品需先用1 mL二甲基亚砜溶解，再用甲醇稀释并定容至刻度。

1.2.1 混合标准工作液的配制分别取质量浓度为0.1 mg/mL的托伐普坦、依他尼酸、阿米洛利、氨苯蝶啶、甲氯噻嗪、甲苯噻嗪标准储备液各100 µL，其他19 种质量浓度为0.1 mg/mL 的利尿剂标准储备液各50 µL置于同一10 mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，混匀，配制成托伐普坦、依他尼酸、阿米洛利、氨苯蝶啶、甲氯噻嗪、甲苯噻嗪的质量浓度为1 µg/mL，其他19 种利尿剂的质量浓度均为0.5 µg/mL 的25种利尿剂混合标准工作液。

1.2.2 混合内标工作液的配制分别取16 种质量浓度为0.1 mg/mL 的利尿剂内标储备液各100 µL，置于同一10 mL 棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，混匀，配制成质量浓度为1 µg/mL 的16 种利尿剂混合内标工作液。

1.3 色谱-质谱条件

Waters ACQUITY HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 µm），流动相A 为0.1%甲酸水溶液，B 相为乙腈；流速0.3 mL/min；柱温30℃，样品进样量为5 µL。梯度洗脱程序：0～2.0 min，95% A；2.0～3.0 min，95%～80% A；3.0～7.0 min，80%～76% A；7.0～10.5 min，76%～70% A；10.5～13.5 min，70%～40% A；13.5～15.0 min，40%～30% A；15.0～18.0 min，30%～15% A；18.0～18.1 min，15%～0% A；18.1～21.0 min，0% A；21.0～22.0 min，0%～95% A。

离子源：加热电喷雾电离源（HESI）；喷雾电压3.5 kV（正离子模式），喷雾电压-3.0 kV（负离子模式），离子传输管温度350 ℃；辅助气加热器温度350 ℃；扫描模式：一级母离子全扫描和数据依赖的二级子离子扫描模式检测（Full MS/dd-ms2）；一级扫描范围为m/z100～1 200（正模式），m/z100～700（负模式）；一级质谱扫描分辨率为60 000，二级扫描分辨率为30 000；归一化碰撞能量为20、30、40 eV；25种利尿剂及16种内标物质的自建筛查数据库信息见表1。

表1 25种利尿剂及16种内标药物的质谱参数Table 1 MS parameters for detection of 25 kinds of diuretics and 16 kinds of the internal standards

（续表1）

1.4 样品前处理

1.4.1 猪、牛、羊及禽类肌肉组织的提取取适量新鲜供试样品肌肉组织搅碎并均质，称取2 g试样（精确至0.01 g）置于50 mL 塑料离心管中，加入100 µL 1 µg/mL 的内标混合工作液，10 mL 80%的乙腈水溶液，涡旋混匀1 min，超声提取15 min。加入3 mL 正己烷溶液，涡旋混匀，4 ℃下9 000 r/min 离心5 min，取下层清液待净化。

1.4.2 蛋、奶样品的提取供试蛋样品去壳后混合均匀，供试奶样品充分混合均匀，称取2 g 试样（精确至0.01 g）置于50 mL 塑料离心管中，加入100 µL 1 µg/mL 的内标混合工作液，乙腈10 mL，涡旋混匀1 min，超声提取15 min。4 ℃下以9 000 r/min离心5 min，取上层清液待净化。

1.4.3 净化吸取上述待净化的清液6 mL，以≤1 mL/min 的速率通过PRiME HLB 固相萃取柱。用带有刻度的玻璃管准确接收流出的样液5 mL。将收集好的样液于40 ℃氮吹至近干后，用50%乙腈水溶液定容至1 mL，过0.22 µm的有机尼龙滤膜，滤液供UPLC-HRMS测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

配制25 种利尿剂混合标准工作液，采用正负离子切换 Full MS/dd-ms2扫描方式分析，根据前期工作基础及相关标准和文献报道［15-16］，加合方式优先考虑［M+H］+及［M-H］-，通过目标物分子式在正负模式分别计算精确质量数，提取离子色谱图，比较待测物在正负离子模式下的响应强度。结果显示，托伐普坦、阿米洛利、丙磺舒、螺内酯、坎利酮、氨苯蝶啶、托拉塞米、甲苯噻嗪、依普利酮、布美他尼、美托拉宗在正模式下响应高，母离子均为［M+H］+，其余目标物在［M-H］-模式下响应更高。此外，螺内酯与坎利酮结构相差-C2H4OS基团，进入离子源后，螺内酯的-C2H4OS基团极易脱落，将螺内酯标准工作液单独进行扫描，其母离子全扫描图如图1所示，m/z417.209 3的响应较弱，而m/z341.210 5具有较强的母离子峰，因此选择其［M-C2H4OS+H］+模式下的理论值341.211 1作为螺内酯的母离子。

图1 螺内酯的一级质谱图Fig.1 MS spectrum of spironolactone in full MS mode

2.2 色谱条件的优化

因螺内酯与坎利酮具有相似的结构，且进入质谱后母离子相同，为实现更好的定性效果，利用色谱柱对两种物质进行分离。在相同液相色谱条件下对50 ng/mL 的25 种利尿剂混合标准溶液进行测定，考察了BEH C18及HSS T3 色谱柱对螺内酯与坎利酮的分离效果，提取m/z341.211 1 离子流图，结果如图2 所示。BEH C18色谱柱不能将两者分离，而HSS T3 色谱柱可实现较好的分离效果，因此本研究选择HSS T3色谱柱进行分析。

图2 HSS T3（A）及BEH C18（B）色谱柱的分离效果Fig.2 Separation results by HSS T3（A） and BEH C18（B） columns

2.3 前处理条件的优化

由于动物源食品中含有较多的脂肪和动物蛋白，为避免将样品中脂肪和蛋白同时提取而影响目标物的提取效果及后续净化过程，同时考虑到25种利尿剂的极性差异较大，本实验选取极性适中、穿透力较强的乙腈作为主要提取试剂。考察了1%甲酸乙腈溶液、乙腈以及80%乙腈水溶液3种试剂对猪肉肌肉组织、蛋、乳中25种利尿剂的提取效果。结果如图3所示，1%甲酸乙腈溶液使精磺胺的回收率显著降低。80%乙腈水溶液与乙腈的提取效果相近，考虑到不同样品基质的特点及净化过程的需求，畜禽肉选取80%乙腈水溶液作为提取试剂，含水量稍多的蛋及奶类样品直接用乙腈提取。

2.4 基质效应

按实验步骤对猪肉肌肉组织、鸡蛋及牛奶进行提取，采用3 种空白基质提取液和50%乙腈水溶液分别配制100 ng/mL的利尿剂标准溶液，测定各利尿剂的质谱响应强度。通过基质配制标准溶液的质谱响应与50%乙腈水溶液标准溶液质谱响应的比值考察基质效应，当比值大于1.2或小于0.8时基质效应显著。结果如图4 显示，在猪肉肌肉组织及牛奶样品中托伐普坦、乙酰唑胺、泊利噻嗪及依普利酮有明显的基质增强效应，阿米洛利、精磺胺等多数利尿剂有显著的抑制作用，为确保方法定量分析的准确性，在实验过程中运用内标定量十分必要。

图4 不同样品中25种利尿剂的基质效应Fig.4 Matrix effects of 25 diuretics in different samples the number denoted was the same as that in Table 1

2.5 方法验证

分别吸取10、20、50、100、200 µL的混合标准工作液，各加入50 µL混合内标工作液，用50%乙腈水溶液定容至1.0 mL，配制成各内标的质量浓度均为50 ng/mL，且托伐普坦、依他尼酸、阿米洛利、氨苯蝶啶、甲氯噻嗪、甲苯噻嗪的质量浓度为10～200 ng/mL，其他利尿剂的质量浓度为5～100 ng/mL的混合标准溶液。25 种利尿剂的对应内标如表2 所示。在优化条件下，以目标物的母离子峰面积与对应内标物质母离子峰面积比值为纵坐标，标准溶液的质量浓度为横坐标，绘制25种利尿剂的标准工作曲线。结果显示，25 种利尿剂在各自线性范围内线性关系良好，相关系数（r2）均大于0.99，检出限为5～10 µg/kg。通过添加1 倍、2 倍和10 倍检出限水平的6 次平行实验对猪肉肌肉组织、鸡蛋、牛奶3 种基质的回收率、相对标准偏差（RSD，n=6）等指标进行考察，结果如表3 所示，方法的回收率为63.0%～116%，RSD为0.80%～14%，满足方法学要求。

表2 25种利尿剂的线性范围、线性系数、检出限及对应内标Table 2 Linear ranges，correlation coefficients（r2），limits of detection（LODs） and the matching internal standards of 25 diuretics

表3 不同样品基质中25种利尿剂的加标回收率及相对标准偏差（%）Table 3 Recoveries and RSDs of 25 diuretics at three levels in different sample matrices（%）

2.6 实际应用

运用此方法，对猪肉、牛肉、鸡肉、蛋、奶等不少于20个市售样品中的25种利尿剂进行测定，均未检出。该方法已在畜禽肉肌肉组织、鸡蛋、牛奶等动物源性大宗食品中危害物的日常监测以及2019年国际篮联篮球世锦赛，2022年冬奥会及测试赛等大型赛事的食品安全技术保障中进行了应用。

3 结 论

本研究构建了食品中 25 种利尿剂类药物的筛查数据库，建立了基于液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱同时测定畜禽肉、蛋、乳等动物源性食品中25种利尿剂的筛查确证及定量分析方法。该方法操作简便，实用性强，且方法线性范围、检出限、准确度及精密度满足方法学要求，可为动物源性食品中利尿剂类药物的日常监管提供技术支撑。