气相色谱-串联质谱法同时测定三七中212种农药残留

2023-10-25王一帆吴易峰徐敦明陈达捷郑文杰

分析测试学报 2023年10期

王一帆，吴易峰，徐敦明*，陈达捷，郑文杰，季超

（1.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002；2.厦门海关技术中心，福建厦门 361026；3.天津师范大学生命科学学院，天津 300382；4.云南农业大学云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南昆明 650091）

三七为五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根和根茎，具有散瘀止血、消肿止痛之功效［1］，素有“南国神草”、“金不换”等美誉，产自云南、广西等地［2-3］。三七也是我国民间最早使用的药食两用中药材之一，被国家卫健委纳入可用于保健食品的物品名单中［4］。近年来由于全球盛起的中药材热潮及其在新冠疫情中发挥的重要作用，中药材的销量大幅增加［5-6］。但农药残留问题一直阻碍着中药材进入国际市场［7-8］。魏丹等［9］通过磁性亲水亲脂平衡萃取材料辅助基质固相分散萃取/高效液相色谱-串联质谱法同时测定中药材中的76 种农药，在1 个金银花样品中检出多菌灵。由于三七的生长周期长、性喜温湿环境，易引起细菌滋生和病虫害［10］。虽然三七早已采用人工种植且栽培技术不断进步［11］，但农药不规范使用现象始终存在，难以符合市场对三七的质量要求。因此，研究三七中多农药残留检测技术对于改善三七市场和控制品质有重要意义。

目前，三七的用药以病害防治为主，虫害防治为辅［12-13］，主要涉及腐霉利、嘧菌胺、烯酰吗啉、克菌丹等农药。世界范围内与三七相关的标准有美国药典［14］、欧盟药典［15］、韩国药典［16］和日本药典［17］等。我国除《中国药典》［18］外，也有GB/T 19086-2008《地理标志产品文山三七》［19］、T/CATCM 003-2017《无公害三七药材及饮片的农药残留与重金属及有害元素残留限量》［20］、GB 2763-2021《食品中农药最大残留限量》［21］等其他相关标准。关于三七中多农残的检测技术有气相色谱法（GC）及液相色谱法（LC）等。气相色谱法适合热不稳定性农药，对于极性强、难挥发的农药普遍采用液相色谱［22］。张飞［23］利用GC 法对三七中 38 种农药残留进行测定，结果良好。张举成等［24］通过LC 法对三七中6种氨基甲酸酯类农药进行检测，均有较好的线性关系。色谱串联质谱法具有更强的抗干扰能力、更高的灵敏度和更好的选择性，可对定性困难、低浓度目标化合物进行测定，为基质复杂、背景干扰严重的中药材农药残留检测提供了技术保障［25］。Fu 等［26］采用气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）检测了三七及其种植土壤中201 种农药，在三七和土壤中分别检出29 种和15 种农药残留，但其前处理耗时较长，不适宜日常监测。Duan 等［27］利用GC-MS/MS 测定了三七中有机氯、有机磷和拟除虫菊酯等116 种农药，方法灵敏度高，重复性好，但其检测物质较少，目标组分无法涵盖三七中可能出现的所有农药。因此，迫切需要开发一种新的多农药残留快速检测方法，以满足中药材三七的日常监测需求。

本研究从上述标准及GB 23200.113-2018《植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定气相色谱-质谱联用法》［28］入手，建立了同时检测212 种农药残留的GC-MS/MS 法。样品采用FaPEx-BKT50 固相萃取（SPE）柱净化，该柱中含有的PSA、C18、HLB、GCB 等吸附剂可有效去除三七中脂类、糖类、挥发油类以及色素等物质，很好地解决三七基质复杂、净化难的问题，且操作简单、可批量处理、节省时间，满足日常监测的需求。该方法操作简单高效，分离净化效果好，成本低，且灵敏度高、选择性好，可为三七药材中多农药残留检测提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

TQ-8040气相色谱-三重四极杆质谱仪（配有电子轰击（EI）源，日本岛津公司）；ST16R 冷冻台式离心机（美国ThermoFisher 公司）；Supelco 24 位固相萃取仪（美国Merck 公司）；N-EVAP-24 氮吹仪（美国Organomation 公司）；SIGMA3-18KS 高速离心机（德国Sigma 公司）；MTV-100 多管旋涡混合仪（杭州奥盛仪器有限公司）；MS3 圆周振荡器（德国IKA 公司）；KQ-700DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声波有限公司）；CPA225D电子天平（德国Sartorius公司）；SF1130中药分析研磨机（长沙中南制药机械厂）。

1.2 材料与试剂

乙腈、乙酸乙酯、甲苯（色谱纯，美国Sigma-Aldrich 公司）；无水硫酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），中性氧化铝柱（50 mg/3 mL，Supelco 公司），FaPEx-BKT50 SPE 柱（50 mg/3 mL，巨研科技有限公司）。212种农药标准品名称见表1，购自天津阿尔塔公司。

表1 212种农药的保留时间及质谱参数Table 1 Retention times and mass spectrometry parameters of 212 pesticides

三七块茎样品购于市场及药店，将其充分研磨成细粉状，储存在铝箔拉链袋中，置于凉爽干燥的环境温度下备用。

1.3 实验条件

1.3.1 样品前处理称取5.0 g（精确至0.01 g）三七粉于50 mL 离心管中，加入15 mL 去离子水混匀，浸泡静置30 min，加入15 mL 乙腈-乙酸乙酯（1∶3，体积比），混匀后振荡提取20 min，加入6 g 无水硫酸钠，4 ℃ 下8 000 r/min 离心5 min，取上清液待净化。

用6 mL 乙酸乙酯润洗FaPEx-BKT50 SPE 柱，取10 mL 上述上清液过柱，收集流出液，用10 mL 乙腈-甲苯（3∶1，体积比）洗脱SPE 柱，收集洗脱液缓慢氮吹近干，用1 mL 乙酸乙酯定容，振荡混匀装瓶待用。

1.3.2 色谱条件色谱柱：Restek Rxi-5silMS 柱（30 m × 0.25 mm，0.25 µm）；升温程序：60 ℃保持1 min，以25 ℃/min 加热至180 ℃，再以10 ℃/min 加热至310 ℃并保持10 min；载气：氦气（He），流速为1.2 mL/min；进样量：1 µL；进样方式：不分流进样，吹扫时间为1 min。

1.3.3 质谱条件电子轰击离子源（EI）；电离能量：70 eV；传输线温度：300 ℃；离子源温度：230 ℃；离子监测模式：多反应监测模式（MRM）；212种农药的保留时间、定性离子、定量离子和碰撞能量等参数见表1。

(续表1)

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 提取溶剂的优化目前三七的提取溶剂主要有乙腈、0.1%乙酸-乙腈、1%乙酸-乙腈等。乙腈是农药残留的常用提取溶剂［29］。在乙腈中加入乙酸乙酯不仅可提高非极性农药的提取效率，而且有助于两相体系的形成，在一定程度上利于去除三七中的极性干扰成分。以三七中常见的8 种不同极性农药为代表，分别考察了乙腈、乙腈-乙酸乙酯（1∶1）、乙腈-乙酸乙酯（1∶3）和乙腈-乙酸乙酯（3∶1）4种提取体系的提取效果（见图1）。结果表明，在 100 µg/kg添加水平下，4种提取体系的提取效果差异较明显，相对于纯乙腈，乙腈-乙酸乙酯可使目标组分的回收率普遍提高，当提取溶剂为乙腈-乙酸乙酯（1∶3）时，目标组分的回收率最好。因此，选用乙腈-乙酸乙酯（1∶3）作为提取溶剂。

图1 不同提取溶剂的提取效果对比Fig.1 Comparison on extraction effects of pesticides with different extractants

2.1.2 其它条件的选择三七的含水量低，为保证最佳提取效果，通常会减少样品量并添加水溶液进行浸泡［30］。目前大多数的研究表明最佳浸泡时间为30 min［31］。因此本研究选取浸泡时间为30 min。中药材的主要提取方式有超声提取［32］和振荡提取等。目前大多数研究选用振荡提取。因此本研究采用振荡提取方式。

2.1.3 净化条件的选择在用无水硫酸钠清除水分的条件下，分别考察了中性氧化铝小柱和FaPEx-BKT50 SPE柱对三七中8种代表性农药的净化效果。FaPEx-BKT50 SPE柱中含有多种吸附剂，其中PSA可去除基质中的有机酸、糖类等极性干扰物；C18可有效去除基质中的脂类、固醇等非极性干扰物；HLB 可去除基质中的部分叶绿素、磷脂和挥发油；GCB 可有效去除基质中的色素。结果表明，FaPEx-BKT50 SPE 柱中的PSA、C18、GCB 以及HLB 等组分对三七的净化效果更强，颜色去除更明显，且目标组分的回收率相对较高。考虑到连续大量进样会对色谱柱和仪器造成损害及污染，最终采用FaPEx-BKT50 SPE柱作为净化条件。

2.1.4 洗脱试剂的选择分别考察了乙酸乙酯、乙腈-甲苯（3∶1）和乙腈-乙酸乙酯（1∶3）作为洗脱试剂时对8种代表性农药提取效果的影响。结果表明，乙腈-甲苯（3∶1）作为洗脱试剂时的提取效果最好，因此选择乙腈-甲苯（3∶1）作为洗脱试剂。

2.1.5 洗脱体积的选择考察了洗脱体积分别为4、6、10 mL 时对8 种代表性农药提取效果的影响。结果表明，洗脱体积为10 mL时的提取效果最好。因此，选择洗脱体积为10 mL。

2.2 质谱条件的优化

根据GC-MS/MS母离子和子离子一一对应的MRM 模式，通过设定多个时间段和扫描通道同时分析多种农药成分，先通过GC对其进行分离和全扫描，确定农药的出峰时间和一级碎片离子。选择离子强度高的一级碎片离子作为母离子，应用电子轰击扫描模式对母离子在不同碰撞能量下进行二次电离，选择信号较强的二级碎片离子作为子离子，以产生信号强度最强的碰撞能量作为最优碰撞能量，优化后的条件见表1。在此条件下，212种农药的总离子流图（TIC）如图2。

2.3 基质效应评价

基质效应（ME）是痕量目标物质谱分析的常见现象。采用下式计算每种化合物的基质效应：ME=［（基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率）-1］× 100%。结果显示，仅有18 种农药的基质效应不明显（＜20%），如灭蚁灵、三氯杀螨砜、甲氰菊酯、β-硫丹等；92 种农药产生中等的基质抑制效应（20%～50%），如残杀威、益棉磷、氯苯嘧啶醇、敌草胺等；102 种农药产生较强的基质抑制效应（≥50%），如哒嗪硫磷、苯醚菊酯、氯菊酯、溴氰菊酯、喹禾灵等。为确保实验结果的准确性，采用基质匹配标准曲线对目标化合物进行定量分析。

2.4 方法性能评价

在10～200 µg/L范围内，根据不同定量下限将基质混合标准溶液配制成一系列混合标准溶液。精确吸取一定量该溶液，用乙酸乙酯逐级稀释成质量浓度为0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 mg/L的标准工作溶液。空白基质溶液氮气吹干后，分别加入1 mL上述标准工作溶液复溶，得到系列基质混合标准工作溶液，采用本方法测定。以进样质量浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。结果表明，212种农药在10～200 µg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数（r2）均大于0.999，检出限（S/N=3，LOD）和定量下限（S/N=10，LOQ）分别为0.003～0.02 mg/kg和0.01～0.05 mg/kg（见表2）。

表2 212种农药的相关系数、检出限、定量下限、加标回收率及相对标准偏差（n=6）Table 2 Correlation coefficients（r2），LODs，LOQs，spiked recoveries and RSDs of 212 pesticide residues（n=6）

目前，国内外关于三七的农药最大残留限量（MRL）标准主要以药典为主。《中国药典》规定了33 种禁限用农药的MRL值；《香港中药材标准》（10th）［33］对20种农药进行了规定，其MRL值为0.05～1.00 mg/kg；《台湾药典》（3th）［34］、《欧盟药典》（10th）、《美国药典》（USP44）、《韩国药典》（10th）和《日本药典》（18th）规定了与三七同科的人参中农药的MRL 值。本研究中212 种农药的LOQ 为0.01～0.05 mg/kg，均低于中国（0.01～5 mg/kg）、欧盟（0.01～4 mg/kg）、美国（0.01～4 mg/kg）、韩国（0.01～5 mg/kg）和日本（0.01～75 mg/kg）建立的MRL值。

2.5 回收率与相对标准偏差

在空白样品中准确添加0.02、0.04、0.1 mg/kg 三水平的农药混合标准溶液，每个浓度做6次平行实验（见表2）。结果表明，212 种农药的平均回收率为60.0%～121%，相对标准偏差（RSD）为0.90%～31%。

2.6 实际样品分析

为验证本方法的实用性并了解市售三七中农药残留情况，采用本方法对采自药店、药材市场及种植地等的66批三七药材进行了检测。结果表明，66批样品中均检出多种农药。从农药种类来看，共检出40 种农药，以腐霉利、毒死蜱、六氯苯、嘧菌胺和烯酰吗啉等检出最多，检出率分别为79.3%、72.1%、75.8%、62.5%、60.9%，其中毒死蜱的最高残留量达324 µg/kg，腐霉利的最高残留量达64µg/kg，烯酰吗啉的最高残留量达1 023 µg/kg。从种植地区来看，所有林下种植的三七农药残留普遍较少，每批检出农药在5 ～ 10种之间；农田种植的三七农药残留检出较多，其中62%的样品检出13～25种农药。整体来看，虽然林下种植的三七农药残留相对较少，但无论是农田种植或是林下种植，三七中毒死蜱、腐霉利、六氯苯的检出率均较高，应引起重点关注和防控，从而提升中药材三七的品质。