高 佳，刘梦颖，任贝贝，路 杨，陈福尊，王丽英*，康维钧

（1.河北医科大学 公共卫生学院，河北 石家庄 050017；2.河北省疾病预防控制中心，河北 石家庄 050021）

蜂蜜是一种纯天然的滋养食品，富含果糖、葡萄糖、维生素、蛋白质、氨基酸、矿物质、脂类、生物酶等营养成分［1-2］。在养蜂过程中，农作物用药和蜂农用药可能导致农药在蜂蜜中残留甚至超标［3-4］，而且在预防和治疗蜜蜂感染性疾病中也存在抗生素使用不当的问题［5］，同时蜜蜂在采蜜过程中可能采到有毒蜜源［6］，以上均可能导致人类食用蜂蜜后引起中毒。中国、日本、美国和欧盟等国家和地区均对蜂蜜中的农药、抗生素等制定了最大残留限量［7-8］，因此，建立一种简单、快速、灵敏、准确的蜂蜜中多种风险物质的筛查方法对于保障人民舌尖上的安全非常重要。

针对蜂蜜的检测方法主要包括高效液相色谱（HPLC）法［9］、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法［3-5］、气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）法［10］等。随着检测仪器、技术的发展，样品前处理技术也逐步简化。糖析萃取是以糖为相分离剂引发亲水有机溶剂与水相分离的前处理技术，在乙腈-水体系中，加入的单糖越多，上层富集的乙腈浓度越高，且糖易溶于水微溶于乙腈，因此糖主要富集在下层水相［11-12］，对仪器影响较小；同时乙腈作为萃取剂，可直接进样，操作更简便。GB 14963-2011《食品安全国家标准 蜂蜜》［13］中规定蜂蜜的果糖和葡萄糖含量应大于等于60 g/100 g，蜂蜜作为一种含糖量很高的食品，采用糖析萃取作为样品前处理技术，不需再另外添加糖即可使乙腈-水体系产生相分离效果，减少杂质引入。

四极杆/轨道阱高分辨质谱是近年来食品检测中使用较多的一种高分辨质谱技术［14-16］，可以实现样品中目标物的高通量准确定性筛查。高分辨质谱技术已应用于蜂蜜中植物毒素及农药残留的检测，如甘源等［17］建立了蜂蜜中 5 种雷公藤毒素的高分辨质谱定量分析方法，昝珂等［18］建立了蜂蜜中28个吡咯里西啶生物碱的快速检测方法，吕冰等［19］建立了蜂蜜中7种新烟碱类农药残留的高分辨质谱检测方法。但目前将高分辨质谱技术应用于蜂蜜中农残、兽残及植物毒源成分同时检测的报道相对较少。

本研究以蜂蜜为研究基质，糖析萃取为前处理技术，通过超高效液相色谱-四极杆/轨道阱高分辨质谱技术（UPLC-Q/Orbitrap-HRMS），建立了68 种常见的农残、兽残及植物毒源成分风险物质的标准质谱数据库，对一级质谱的分子离子精确质量数、保留时间、同位素丰度比进行初筛，并采用二级碎片离子解析对初筛的阳性化合物进一步确证，实现了蜂蜜中风险物质的快速筛查。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂及材料

Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）、Q-Exactive Plus 四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱系统及 Dionex Ultimate 3000 超高效液相色谱系统（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；JJ 600电子天平（0.01 g，常熟市双杰测试仪器厂）；ME204E电子天平（0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）；Multi Reax试管振荡器（德国Heidolph公司）；3-30K 高速冷冻离心机（美国 Sigma 公司）。

甲醇、乙腈（色谱纯，美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；甲酸（色谱纯，德国默克公司）；实验用水均为屈臣氏蒸馏水。

阿维菌素类药物混标（依普菌素、阿维菌素B1a、多拉菌素、伊维菌素B1a）、有机磷农药混标（敌百虫、甲基吡啶磷、敌敌畏、马拉硫磷、烯虫磷、蝇毒磷、倍硫磷、二嗪磷、辛硫磷）、氨基甲酸酯类杀虫剂混标（抗蚜威-脱甲基、涕灭威砜、3-羟基克百威、抗蚜威、涕灭威、残杀威、恶虫威、克百威、甲萘威、乙硫苯威、灭除威、异丙威、3，4，5-混杀威、仲丁威、灭梭威、苯醚威、茚虫威）均购自上海安谱科技有限公司；雷公藤甲素、雷公藤次碱、雷公藤红素、雷公藤吉碱、雷公藤内酯甲、醚菊酯、哒螨灵、5-甲基糠醛、氟虫腈及其代谢物（氟甲腈、氟虫腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈砜）、新烟碱杀虫剂混标（环氧虫啶、噻虫胺、吡虫啉、氯噻啉、啶虫脒、噻虫啉、哌虫啶）均购自天津阿尔塔科技有限公司；磺胺硝苯、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺甲唑、周效磺胺、磺胺异唑、磺胺苯酰、磺胺苯吡唑、磺胺氯吡嗪、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹啉、氯霉素均购自德国 Dr.Ehrenstorfer 公司。

32份蜂蜜样品购自超市和农贸市场。

1.2 溶液制备

标准储备液：精确称取化合物10 mg，用甲醇溶解配制成 1 000 mg/L 的储备液，于-20 ℃储存；混合标准中间液：准确吸取各类标准储备液适量，用甲醇稀释，配制成 10.0 mg/L 的混合标准中间液，于-20 ℃储存；混合标准溶液：使用时用基质匹配溶液稀释配制成 1.00 mg/L 的混合标准溶液，临用现配。

1.3 样品前处理

精确称取蜂蜜样品2 g（精确至0.01 g）置于15 mL具塞离心管中，加入 1.5 mL水，混匀；加入3.5 mL乙腈，涡旋10 min 使其混合均匀。8 000 r/min 离心 10 min，取1.5 mL上清液至2 mL离心管中，15 000 r/min 离心 10 min，取上清液供UPLC-Q/Orbitrap-HRMS 分析测定。

1.4 色谱条件

Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）；流动相由 0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）组成。梯度洗脱程序：0～2.5 min，95%～90% A，2.5～8.0 min，90%～5% A；8.0～12.0 min，5% A；12.0～14.0 min，5%～95% A；14.0～17.0 min，95% A。流速和柱温分别设定为 0.3 mL/min 和40 ℃，样品进样量为5 µL。

1.5 质谱条件

离子源：加热电喷雾离子源； 喷雾电压 3.8 kV（正离子模式）、3.2 kV（负离子模式）；透镜电压：50.0 V；以氮气为鞘气和辅助气，鞘气压力2.8×105Pa（40 psi），辅助气压力1.0×105Pa（15 psi）；离子传输管温度 380 ℃；辅助气加热器温度 350 ℃； 扫描模式：一级母离子全扫描和数据依赖的二级子离子扫描监测模式（Full MS/dd-MS2）；一级质谱扫描范围m/z100～1 000，扫描分辨率70 000；二级扫描分辨率35 000；归一化碰撞能为 20、40、60 eV。

68种风险物质的详细信息见表1。

表1 68种风险物质的名称、CAS 号、分子式、理论质量数、加合方式和保留时间Table 1 Compound name，CAS number，molecular formula，theoretical mass，adduct and retention time of 68 kinds of risk substance

(续表1)

1.6 结果判定

依据欧盟 2002/657/EC 准则［20］，使用高分辨质谱法对目标化合物进行定性分析时，有 1 个母离子和 1 个子离子，或 2 个子离子匹配，即可确定样品中存在目标化合物。本研究对初筛阳性的样品依据母离子与碎片离子进行判定，若母离子和碎片离子的测量精确质量数与理论精确质量数偏差小于5×10-6且碎片离子的相对丰度比满足欧盟 2002/657/EC 准则要求，即可确定样品中含有该化合物。

2 结果与讨论

2.1 仪器条件选择

2.1.1 色谱条件优化对目标化合物标准品进行质谱全扫描发现：大部分化合物在 ESI+模式下生成正离子；氯霉素、磺胺硝苯、氟甲腈、氟虫腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈砜、雷公藤红素在ESI-模式下生成负离子。比较了正、负离子模式同时扫描时，水-甲醇、5 mmol/L 乙酸铵-甲醇和0.1%甲酸-甲醇3种流动相的效果。结果表明，部分化合物在水-甲醇流动相中生成的正离子的响应较低，但在水相中加入0.1%甲酸后正离子的响应明显提高且对负离子响应影响不大，如磺胺氯吡嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺苯酰、雷公藤次碱等正离子的响应提高，雷公藤红素、磺胺苯酰等目标物的峰形得到明显改善；而以5 mmol/L 乙酸铵为水相时，化合物保留时间的稳定性及分离效果无明显提高，故本实验选用0.1%甲酸-甲醇作为流动相。图1为蜂蜜在正、负离子模式下的总离子流图。

图1 蜂蜜在正（A）、负（B）离子模式下的总离子流图Fig.1 Total ion flow diagrams of honey under positive（A） and negative（B） modes

2.1.2 质谱条件优化考虑到不同化合物的电离方式不同，本研究选择正、负离子模式同时进行扫描，并根据68种化合物的分子量设定母离子的扫描范围为m/z100～1 000。比较了正离子模式下目标化合物［M+H］+峰和［M+Na］+峰的响应，当［M+Na］+峰明显高于［M+H］+峰时，选择［M+Na］+峰为定量峰，否则选择［M+H］+峰进行定量。

2.2 样品前处理方法的选择

蜂蜜较为粘稠，故先加水使其溶解再加乙腈进行提取。分别向2 g 蜂蜜中加入0.5、1.0、1.5、2.0 mL 水，充分振摇使其溶解。加入0.5 mL 水的蜂蜜粘稠不均匀，其余3 组为均匀液态，故2 g 蜂蜜至少需加入1.0 mL水进行溶解。

分别将4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0 mL 的水与2 g 蜂蜜充分混匀，再加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 乙腈充分混匀，使体系中水和乙腈的总体积为5.0 mL（即乙腈的体积分数 分 别 为20%、 30%、 40%、 50%、 60%、70%、80%），8 000 r/min 离心 10 min。结果表明，使用体积分数为20%、30%的乙腈-水时提取液不分层，其余5 组提取液分层且上层乙腈相澄清透明。

向阴性蜂蜜样品中加入100 µL 1.00 mg/L的混合标准溶液，使用体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%的乙腈-水溶液按“1.3”进行处理，进样分析。各化合物经不同体积分数的乙腈-水提取后的回收率如图2所示。从图中可看出使用70%乙腈-水溶液时，目标风险物质的加标回收效果最佳，故选择70%乙腈-水进行样品提取。

图2 目标风险物质经不同体积分数的乙腈-水提取后的回收率Fig.2 Recoveries of target risk substances extracted with different volume fraction of acetonitrile-water

2.3 方法学考察

2.3.1 基质效应基质效应（ME）［21］指待测物质受基质影响，导致化合物响应值产生增强或抑制的现象。采用阴性蜂蜜的空白基质溶液和乙腈分别配制标准曲线，用基质匹配曲线的斜率与纯溶剂曲线斜率的比值评估基质效应，ME在0.80～1.20之间时，基质效应可忽略；ME＞1.20为基质效应增强，ME＜0.80为基质效应抑制。68 种风险物质的 ME 值见表2，其中37种风险物质的基质效应介于 0.80～1.20 之间；9种风险物质的基质效应低于 0.80，介于0.452～0.799之间，雷公藤内酯甲、甲萘威、恶虫威、涕灭威、烯虫磷等化合物存在明显的基质抑制现象；21种风险物质的基质效应介于1.204～1.688之间，氯霉素的基质效应为2.010，噻虫啉、3-羟基克百威、甲基吡啶磷、啶虫脒、氯霉素等化合物存在明显的基质增强现象。因此本研究采用基质匹配标准曲线降低基质效应对定量结果的影响。

表2 68种风险物质的线性范围、相关系数、检出限、定量下限、回收率、相对标准偏差及基质效应Table 2 Linear ranges，correlation coefficients，LODs，LOQs，recoveries，RSDs and ME results of 68 risk substances

2.3.2 线性范围、检出限与定量下限用阴性蜂蜜的空白基质溶液配制一系列质量浓度的标准工作溶液进行检测，目标风险物质在一定质量浓度范围内线性良好，相关系数（r2）为 0.991 4～0.999 9；向空白样品中添加低浓度水平的标准溶液，按“1.3”进行前处理后测定，分别以3倍、10 倍信噪比计算方法检出限（LOD）和定量下限（LOQ）。测得 68 种农药的 LOD 为 0.03～2.73 µg/kg，LOQ 为0.10～9.00µg/kg。68 种风险物质的线性范围、检出限和定量下限见表2。

2.3.3 回收率及相对标准偏差取蜂蜜阴性样品添加不同水平（1.75、8.75、35.0、70.0 µg/kg）的68 种风险物质的混合标准溶液，每个水平重复6 次实验，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD）。方法的平均加标回收率为50.7% ～ 122%，RSD为 1.0% ～15%。

（续表2）

2.4 实际样品测定

采用本方法对从市场采购的32 份蜂蜜样品进行测定，在12 份样品中检出蝇毒磷，含量范围为0.74～24.87 µg/kg，其余样品均未检出。蝇毒磷母离子的精确质量数为m/z363.021 74，测量精确质量数为m/z363.021 12，偏差为1.7×10-6，小于5×10-6，且其保留时间、同位素丰度比与标准品一致。采用 Full MS/dd-MS2采集蝇毒磷标准品和阳性样品信号进行确证，在一级质谱图中可见蝇毒磷的分子离子峰［M+H］+（m/z363.021 74），二级质谱图中可见其特征碎片离子m/z226.992 52、306.958 74、211.015 47、114.961 45。样品的二级质谱图与标准品二级质谱图匹配良好，可确认结果的准确性。蝇毒磷标准品及其阳性样品的提取离子色谱图、同位素丰度比、一级质谱图及二级质谱图见图3。

图3 蝇毒磷标准品（A）和阳性样品（B）的提取离子色谱图（1）、同位素丰度比（2）、一级质谱图（3）及二级质谱图（4）Fig.3 Extraction ion chromatograms（1），isotope abundance ratios（2），primary mass spectrograms（3） and secondary mass spectrograms（4） of coumaphos standard（A） and a positive sample（B）

3 结 论

本研究建立了蜂蜜中68 种化学风险物质的超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱分析方法。样品经70%乙腈-水提取，糖析萃取后测定。方法操作简单、快速、灵敏，检出限为 0.03～2.73 µg/kg，定量下限为0.10～9.00 µg/kg，平均加标回收率为 50.7% ～ 122%，RSD 为1.0% ～15%。该方法通量高、速度快、定量准确，可用于蜂蜜中风险物质的快速筛查。