黄丕苗，苏爱华，崔春

（华南理工大学食品科学工程学院，广东广州 510640）

慢性失眠症、短期失眠症及其他类型的失眠症均为典型的睡眠障碍症状[1]。睡眠是生命的基本需要，睡眠不仅可以消除疲劳、恢复精力，而且可以保护大脑、增强机体免疫力。长时间睡眠不足会破坏身体多个系统的功能，而健康丰富的睡眠有助于身心健康。据《2022中国国民健康睡眠白皮书》显示，我国老年人自我认知睡眠质量非常差，42%的老年人入睡时长超过半小时，失眠发生率高达21%，而成人中患有不同程度失眠症高达57%，且睡眠质量差发生率有随年龄增长而上升的趋势，故我国国民失眠率亦可能逐年升高。因此，对提高睡眠、改善失眠的研究也就显尤为迫切[2]。

酸枣仁（Ziziphus jujuba）为鼠李科枣属植物干燥的种子，主要活性成分包括皂苷、三萜类化合物、黄酮类化合物等，具有宁心安神、提高免疫力、养肝、镇静催眠的作用[3,4]，被称为“东方睡果”。酸枣仁提取物是临床上中医药治疗失眠症状的首选药物[5,6]。龙眼肉提取物（Longan Aril Extract）主要提取自龙眼干的部分假种皮，其主要化学成分包括挥发性成分萜类、甾醇、磷脂、鞣质、多糖等化合物，具有养血安神、调节失眠、抗应激等功效[7]，可以作为医药保健品和饮料食品添加剂。γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）是以L-谷氨酸钠为原料，经短乳杆菌发酵、纯化、过滤浓缩、结晶、分离，喷雾干燥等工艺而制成。作为一种抑制性神经递质起到分子信号的作用，GABA可进入下丘脑周围区域等缺乏血脑屏障的大脑外周神经系统，抑制大脑神经系统的兴奋性，从而改善失眠症状[8]，2009年就将被列入新资源食品原料[9]。

有鉴于此，本研究根据《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）对酸枣仁提取物、龙眼肉提取物和γ-氨基丁酸改善小鼠睡眠功能的效果进行了评价。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级ICR健康雄性小鼠120只，体质量18～22 g。小鼠购于南京君科生物工程有限公司（许可证号SCXK（豫）2020-0005），饲料购于广东省医学实验动物中心。

1.2 材料

龙眼肉提取物（水提物）：购于黄山华绿园生物科技有限公司提供，多糖含量≥30%；酸枣仁提取物，自制，经粉碎、水提、浓缩、喷雾干燥（加糊精），黄酮含量≥20%、多糖含量≥35%；3 g酸枣仁可制得1 g提取物；γ-氨基丁酸：购于南通励成生物工程有限公司（纯度≥95%）。

1.3 试剂

巴比妥钠和戊巴比妥钠（分析纯）：北京华美生物科技技术有限公司。

1.4 主要仪器与设备

Coleparmer秒表购于广州市赛拓仪器科技有限公司；XPR226DR/AC电子天平梅特勒托利多科技（中国）有限公司。

1.5 方法

依据《保健食品检验与评价技术规范》[10]对小鼠直接睡眠实验、延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验巴比妥钠睡眠潜伏期实验进行检测。

1.5.1 延长戊巴比妥钠睡眠时间预试验

根据《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）进行延长戊巴比妥钠睡眠时间预实验。参考酸枣仁提取物成人日推荐量为2.4 g[11]，龙眼肉提取物成人日推荐量为3 g，γ-氨基丁酸成人日推荐量为小于500 mg[9]，成人体质量以60 kg计，即酸枣仁提取物相当于40 mg/(kg·d)，龙眼肉提取物相当于50 mg/(kg·d)，γ-氨基丁酸相当于8.33 mg/(kg·d)。取正常饲喂小鼠40只，将动物的体质量均匀分配，以8只为一组分成5组，选择一系列剂量（40、45、50、55和60 mg/kg）进行预试验，注射剂量为0.2 mL，完成动物分组和剂量计算后腹腔注射戊巴比妥钠溶液，观察出现的症状并记录。使用55 mg/kg的注射剂量可以使实验小鼠全部进入睡眠状态，且其平均睡眠时间控制在60 min以内，是研究供试品延长戊巴比妥钠睡眠时间的最合适剂量。

1.5.2 戊巴比妥钠阈下剂量催眠预试验

根据《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）进行戊巴比妥钠阈下剂量催眠预实验。取正常饲喂小鼠40只，将动物的体质量均匀分配，以12只为一组分成4组，选择一系列剂量（18、22、26和30 mg/kg）进行预试验，注射剂量为0.2 mL，完成动物分组和剂量计算后腹腔注射戊巴比妥钠溶液，观察出现的症状并记录。确定使用30 mg/kg的注射剂量可以使16%的实验小鼠翻正反射消失。

1.5.3 巴比妥钠睡眠潜伏期预试验

取正常饲喂小鼠36只，将动物的体质量均匀分配，以6只为一组分成6组，选择一系列剂量（44、48、52、56和60 mg/kg）进行预试验，注射剂量为0.2 mL。确定注射量为200 mg/kg可以使100%的实验小鼠入睡，且入睡潜伏期为5.09 min，为实验可操作的合适范围。

1.5.4 酸枣仁提取物、龙眼肉提取物和γ-氨基丁酸剂量

酸枣仁提取物高（H）、中（M）、低（L）剂量分别为110、55和27.5 mg/(kg·d)；龙眼肉提取物H、M、L剂量分别为266、133和66.5 mg/(kg·d)；γ-氨基丁酸H、M、L剂量分别为33.3、16.7和8.3 mg/(kg·d)。

1.5.5 受试物给予方式

每组动物每天进行称质量，并按2.0 mL/100 g体质量经口灌胃给予不同浓度的受试物及蒸馏水，连续灌胃30 d。

1.6 实验数据统计

实验数据用SPSS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 3种功能因子对小鼠直接睡眠作用观察结果

由表1可知，酸枣仁提取物、龙眼肉提取物和γ-氨基丁酸在高中低3个剂量组对实验小鼠直接睡眠作用均无差异，且与对照组相比差异均无统计学意义（P＞0.05）。此外，3种功能因子高中低剂量组小鼠体质量差异无显著性；给予受试物后各组小鼠的生活状态正常，毛发光亮，未观察到直接睡眠作用。

表1 3种功能因子对小鼠直接睡眠作用观察结果(x±s)Table 1 The effect of three functional factors on the direct sleep of mice

2.2 3种功能因子对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响

由表2可知，γ-氨基丁酸高中低剂量、酸枣仁提取物高中剂量和龙眼肉低剂量组均可显著延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中酸枣仁提取物高剂量组对延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠的作用最好，睡眠时间能达到3 538.35 s，但酸枣仁低剂量组和龙眼肉提取物高中剂量和对延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间，与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。黄远英等[12]研究酪蛋白水解物与γ-氨基丁酸复配制剂对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响时发现，复配制剂高剂量和中剂量可显著延长其睡眠时间10%左右。与之对比，本实验酸枣仁高剂量组和γ-氨基丁酸高剂量组可将戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间延长1倍以上；酸枣仁中剂量组和γ-氨基丁酸中剂量组可延长睡眠时间50%左右。两者的差异可能是本实验用量略高于黄远英等。3种功能因子对小鼠体质量均无显著影响。

表2 3种功能因子对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响(x±s)Table 2 The Effects of three functional factors on sleep time of mice induced by pentobarbital sodium

2.3 三种功能因子对戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用的影响

由表3可知，3种功能因子中γ-氨基丁酸对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用最大，12只小鼠中高中低剂量均有2只入睡，睡眠发生率达到16.67%；酸枣仁提取物高剂量和低剂量对12只小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用时均只有1只入睡；龙眼肉提取物高剂量对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用时，12只小鼠中有1只入睡，睡眠发生率只有8.33%。三种功能因子的高中低剂量组动物入睡数与对照组进行比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），但γ-氨基丁酸提高阈下剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠发生率作用略高于酸枣仁提取物和龙眼肉提取物。袁根良等[13]研究天麻酸枣仁复合胶囊对阈下剂量戊巴比妥纳诱导睡眠发生率的影响时发现，对照组相比，复合胶囊高中低剂量对小鼠的睡眠发生率的差异不显著，且无统计学意义（P＞0.05），这与本研究得出的酸枣仁提取物对阈下剂量戊巴比妥纳诱导的小鼠睡眠发生率无明显作用相符。刘春芳等[14]研究灵芝多糖γ-氨基丁酸片制剂对戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用时发现，灵芝多糖γ-氨基丁酸片高低剂量作用时12只小鼠中有3只入睡，中剂量有2只入睡，证实该片剂对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验与对照组相比无显著性差异，其结论与本实验的结果一致。

表3 三种功能因子对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用的影响(x±s)Table 3 The effects of three functional factors on hypnotisubthreshold pentobarbital sodium in mice

2.4 三种功能因子对巴比妥钠诱导小鼠入睡潜伏期的影响

由表4可知，酸枣仁提取物高中低剂量组均可缩短巴比妥钠催眠的小鼠的入睡潜伏期，但只有高、中剂量组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。龙眼肉提取物和γ-氨基丁酸还延长了巴比妥钠催眠的小鼠的入睡潜伏期，但与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。陈希民等[15]研究酸枣仁提取物、茶氨酸、γ-氨基丁酸复合配方产品对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响时发现，复合配方低、中、高剂量组的小鼠入睡潜伏期时间分别缩短12.48%、24.19%、24.07%，且与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。与之相比，本论文中巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期实验，酸枣仁提取物中、高剂量组（55、110 mg/kg·d）作用后，小鼠入睡潜伏期分别为177.20、145.06 s，与对照组相比，中、高剂量组小鼠入睡潜伏期时间分别缩短44.33%、51.67%，差异有统计学意义（P＜0.05）。随着剂量的增加，小鼠入睡潜伏期也逐渐缩短，说明酸枣仁提取物缩短小鼠入睡潜伏期功效具有剂量-效应关系。两者结果的差异可能是本实验是单独使用酸枣仁提取物，而黄远英等[12]是将酸枣仁提取物与茶氨酸、γ-氨基丁酸进行复配，从而也说明在此剂量下，酸枣仁提取物单独使用的功效高于与茶氨酸、γ-氨基丁复配使用。

表4 三种功能因子对巴比妥钠诱导小鼠入睡潜伏期的影响（x±s）Table 4 The effect of sample on the latency of mice induced by sodium sodium

3 结论

采用经口灌胃法给予小鼠不同剂量的酸枣仁提取物、龙眼肉提取物和γ-氨基丁酸30 d后，γ-氨基丁酸高中低剂量、酸枣仁提取物高中剂量和龙眼肉低剂量组均可显著延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间，其中酸枣仁高剂量组和γ-氨基丁酸高剂量组可将戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间延长1倍以上；酸枣仁中剂量组和γ-氨基丁酸中剂量组可延长睡眠时间50%左右。此外，酸枣仁提取物高中低剂量组均可缩短巴比妥钠催眠的小鼠的入睡潜伏期，但仅高剂量组和中剂量组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。同时，酸枣仁提取物、龙眼肉提取物和γ-氨基丁酸的所有剂量组对小鼠体质量无显著性影响，给予受试物后各组小鼠活动正常，毛发光亮，都对直接睡眠无明显作用。

本论文可为酸枣仁提取物、龙眼肉提取物与γ-氨基丁酸复配生产改善睡眠产品研究奠定基础。