林鹏，黄玉雯，李学鹏，励建荣

（渤海大学食品科学与工程学院，渤海大学海洋研究院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州 121013）

诺如病毒（Norovirus，NoV）曾称诺瓦克病毒（Norwalk Viruses），隶属于杯状病毒科（Caliciviridae），诺如病毒属（Norovirus）成员，是一种单股正链RNA病毒。1968年美国俄亥俄州诺沃克市暴发了NoV感染，随后世界各地相继发现该病毒的其它亚型[1]。NoV基因组包含三个开放阅读框（Open Reading Frames，ORFs），其中ORF1编码非结构蛋白，ORF2编码衣壳蛋白（VP1），ORF3编码次要结构蛋白（VP2）[2]。近年来由于新的流行毒株出现，根据VP1蛋白的氨基酸序列和ORF1的RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）区的核苷酸多样性，分为不同的基因群和P群，进一步将NoV分为10个基因群（GI-GX）和不同的P型，其中GⅠ、GⅡ、GⅣ、GVIII和GIX基因群主要感染人类，被通称为人源诺如病毒（Human Norovirus，HuNoV）[3]。根据流行病学研究表示，HuNoV是引起流行性、自限性急性胃肠炎的主要病原体之一，约占所有急性胃肠炎病例的五分之一[4]。对健康的成人来说，NoV引起一种急性自限性的胃肠道感染；但在老年人、儿童和免疫功能低下的患者中NoV则会造成较高的发病率和死亡率[5]。NoV感染的主要传播为粪便-口途径，主要由于食用含有NoV的食品，以生食贝类或者食用加热不彻底的贝类最为常见[6]。全年均可发生，但多发生在秋冬季节[7]。自2013年以来，我国每年因NoV引起的急性胃肠炎病例逐年递增，其主要临床表现为腹泻和呕吐等[8]。NoV具有较强的感染性，且目前暂无特效药物。因此，由NoV引起的食品安全问题亟待关注。

NoV目前主要的流行毒株包括GⅠ.3、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.13和GⅡ.17型，这些基因型很容易产生新的突变，且新的突变型通常具有更强的传染性和变异性[9]。在过去的30年中，GⅡ.4型占据主导地位，导致了大约70% NoV的暴发[10]。有证据表明，每2~3年GⅡ.4型都会出现一种新的变异株[11]。目前GⅡ.4型主要有六种流行变异株，分别为Grimsby 1995、Farmington Hills 2002、Hunter 2004、Den Haag 2006b、New Orleans 2009和Sydney 2012[12]。

VP2蛋白作为NoV次要结构蛋白，可以和VP1蛋白组成NoVs病毒颗粒[13]；然而，VP2蛋白对于病毒颗粒不是必需的，主要对病毒的稳定性和衣壳化起到非常重要的作用[14,15]。有研究表明，VP2蛋白和VP1蛋白相互作用可促进衣壳蛋白的表达，进而影响NoV的复制[16,17]。NoV VP2蛋白具有较高的突变性，在不同毒株的NoV可能起到不同的生物学作用[18]。

NoV已被公认为是最主要的病毒性胃肠病原体之一，影响着全世界各个年龄段的数亿人，造成每年全球直接经济损失为42亿美元，社会经济损失603亿美元[19,20]。因此，研究NoV具有非常重要的现实意义。但目前关于NoV流行毒株VP2蛋白研究相对较少，对其生物学作用了解不够全面，不能对NoV VP2蛋白的理化性质、蛋白结构等提供有效的参考[21]。本研究采用生物信息学对NoV流行毒株VP2蛋白结构与功能进行预测，为进一步研究VP2蛋白功能及开发亚单位疫苗提供理论支持，以此为解决由NoV引起的食品安全问题提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 毒株序列

GⅡ.4 LN-2021-18毒株VP2基因序列由本实验室分离病毒测序。

1.2 参考毒株序列

综上所述根据目前主要的NoV流行毒株，选取以下12株进行分析[9-12]。NoV GI.3 Nashville 2016毒株（GenBank：MK073893.1）；NoV GⅡ.2 Japan 2020毒株（GenBank：LC646332.1）；NoV GⅡ.3 AnnArbor 2016毒株（GenBank：MK073886.1）；NoV GⅡ.4 Tokyo 2021毒株（GenBank：LC699541.1），NoV GⅡ.4 Sydney 2016毒株（GenBank：MK073885.1），NoV GⅡ.4 Sydney 2012毒株（GenBank：KU678201.1），NoV GⅡ.4 Johannesburg 2009毒株（GenBank：KP784691.1），NoV GⅡ.4 Den Haag 2006b毒株（GenBank：KM245071.1），NoV GⅡ.4 Hong Kong 2004毒株（GenBank：HM802551.1），NoV GⅡ.4 Houston 2002毒株（GenBank：EU310927.1）；NoV GⅡ.13 USA 2010毒株（GenBank：JN899242.1）；NoV GⅡ.17 CN 2014毒株（GenBank：KU757047.1）。

1.3 实验方法

1.3.1 VP2蛋白序列分析

使用MEGA 6.05软件对VP2蛋白的氨基酸序列进行分析比对，采用Neighbor-joining法构建VP2蛋白进化树。

1.3.2 VP2蛋白理化性质的预测

使用在线软件ProtParam Tool（https://web.expasy.org/protparam/）预测VP2蛋白的带电荷氨基酸数量、不稳定系数、平均吸水系数、相对分子质量、氨基酸组成及等电点；进一步使用ProtScale在线软件（https://web.expasy.org/protscale/）预测VP2蛋白的亲疏水性。

1.3.3 VP2蛋白磷酸化位点和糖基化位点的预测

在线软件NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测VP2蛋白的潜在磷酸化位点；在线软件NetOGlyc 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）预测VP2蛋白的潜在糖基化位点。

1.3.4 VP2蛋白跨膜区及信号肽的预测

在线软件TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测VP2蛋白的跨膜区；在线软件SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）预测VP2蛋白的信号肽。

1.3.5 VP2蛋白二级结构的预测

在线软件PSIRED Workbench（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）预测VP2蛋白的二级结构。

1.3.6 VP2蛋白三级结构的预测

使用在线软件Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi? id=index）建立VP2蛋白的空间构象，并进行高级结构的预测。

1.3.7 VP2蛋白潜在抗原表位的预测

在线软件Predicting Anti-genic Peptides（http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl#:~:text=Ant igenic%20peptides%20are%20determined%20using%20 the%20method%20of,The%20reported%20accuracy%20 of%20 method%20is%20about%2075% 25.）预测VP2蛋白的抗原决定簇；使用在线软件ABCpred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/）预测VP2蛋白的潜在B细胞抗原表位。

1.4 数据分析

试验数据使用GraphPad Prism 7.0软件进行分析，结果以平均值表示。

3 结果分析

3.1 VP2蛋白进化树构建

进化树构建结果显示GⅡ.4 LN-2021-18与GⅡ.4 Sydney 2016毒株位于同一个小分支，亲缘关系最近；GⅠ.3 Nashville 2016、GⅡ.2 Japan 2020、GⅡ.3 AnnArbor 2016、GⅡ.13 USA 2010和GⅡ.17 CN 2014同属于一个大分支（图1）。

图1 NoV VP2蛋白的进化树分析结果Fig.1 Evolutionary tree analysis result of NoV VP2 protein

3.2 VP2蛋白的理化性质

使用ProtScale在线软件预测NoV流行毒株VP2蛋白的理化性质，结果显示NoV VP2蛋白均为亲水蛋白（图2）；NoV VP2蛋白的平均等电点为10.47，平均吸水系数为-0.47，平均不稳定系数为47.91，碱性氨基酸平均含量为11.60%；其中GI.3 Nashville 2016毒株VP2蛋白的平均吸水系数、不稳定系数和碱性氨基酸含量较低，分别为-0.27、42.13和9.30%；GⅡ.17 CN 2014毒株VP2蛋白的不稳定系数较高为56.74。NoV流行毒株VP2蛋白具体理化性质（表1）。

表1 NoV流行毒株VP2蛋白的理化性质Table 1 Physicochemical properties of VP2 protein of NoV epidemic strains

图2 GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白的亲疏水性预测结果Fig.2 Hydrophobicity prediction results of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein

3.3 VP2蛋白磷酸化位点和糖基化位点

NetPhos 3.1 Server和NetOGlyc 1.0 Server分别预测VP2蛋白潜在的磷酸化位点和糖基化位点。结果显示，NoV VP2蛋白含有多个磷酸化位点（图3）和糖基化位点（图4）。NoV VP2蛋白潜在的磷酸化位点平均为43个和糖基化位点平均存在2个（表2）；8种GⅡ.4亚型毒株在第20、92、132、160、163、167、175、180、184、190、193、199、209、219、225、226、228、229、230、235、244和266位存在共同丝氨酸位点，第71、94、114、124、176、194、222、236和251位存在共同苏氨酸位点，第116位存在共同酪氨酸位点；GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.13、GⅡ.17型毒株在第20、81、168和171位存在共同丝氨酸位点，第103和121位存在共同苏氨酸位点；GⅠ.3、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.13、GⅡ.17型毒株在第81位有共同丝氨酸位点。除GⅡ.4 Hong Kong 2004，其余7种GⅡ.4型毒株均在第171位存在糖基化位点。

表2 NoV流行毒株VP2蛋白的磷酸化位点和糖基化位点Table 2 Phosphorylation sites and glycosylation sites of VP2 protein of NoV epidemic strains

图3 GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白磷酸化位点预测结果Fig.3 Prediction results of phosphorylation sites of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein

图4 GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白糖基化位点预测结果Fig.4 Prediction results of glycosylation sites of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein

3.4 VP2蛋白跨膜区及信号肽的预测

TMHMM Server v.2.0和SignalP5.0 Server在线软件分别预测VP2蛋白是否存在跨膜区和信号肽。结果显示，大多数NoV流行毒株VP2蛋白无跨膜区和信号肽（图5a和图6a）；然而GⅠ.3毒株VP2蛋白有跨膜区和信号肽（图5b和图6b）。

图5 VP2蛋白跨膜结构域预测结果Fig.5 Prediction results of transmembrane domain of VP2 protein

图6 VP2蛋白信号肽预测结果Fig.6 Prediction results of signal peptide of VP2 protein

3.5 VP2蛋白二级结构的预测

采用PSIPRED软件预测NoV流行毒株VP2蛋白二级结构主要形式，结果分析发现所有VP2蛋白结构相似（图7）；同时利用SOPMA预测VP2蛋白二级结构主要形式的含量，预测结果显示NoV流行毒株VP2蛋白中α-螺旋（蓝色）平均占比38.17%、延伸链（红色）平均占比7.45%、β转角（绿色）平均占比6.25%、无规则卷曲（紫色）平均占比48.13%（图8和表3）；进一步分析发现GⅠ.3 Nashville 2016毒株VP2蛋白以α-螺旋为主，其余12种蛋白均以无规则卷曲为主。无规则卷曲较为松散且易发生扭曲盘旋并暴露在蛋白质表面，较易成为抗原表位。

表3 NoV流行毒株VP2蛋白的二级结构Table 3 Secondary structure results of VP2 protein of NoV epidemic strains

图7 PSIPRED软件预测的GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白的二级结构Fig.7 Secondary structure results of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein measured on PSIPRED software

图8 SOPMA软件预测的GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白的二级结构Fig.8 Secondary structure results of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein measured on SOPMA software

3.6 VP2蛋白三级结构的预测

通过在线网站Phyre2对NoV流行毒株VP2蛋白的三级结构分析。预测结果发现VP2蛋白最高的置信度为56.70%，蛋白质的覆盖率为10%。其中GⅡ.3毒株、GⅡ.4 Tokyo 2021毒株、GⅡ.4 Hong Kong 2004毒株、GⅡ.4 Sydney 2016毒株和GⅡ.4 LN-2021-18毒株相似（图9a）；GⅠ.3毒株、GⅡ.13毒株和GⅡ.17毒株相似（图9b）；GⅡ.2毒株（图9c）；GⅡ.4 Houston 2002毒株和GⅡ.4 Johannesburg 2009毒株相似（图9d）；GⅡ.4 Den Haag 2006b毒株和GⅡ.4 Sydney 2012毒株相似（图9e）。

图9 VP2蛋白三级结构空间模型预测结果Fig.9 Prediction results of tertiary structure spatial model of VP2 protein

3.7 VP2蛋白潜在抗原表位的预测

抗原决定簇是蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域，一般由6~12个氨基酸或碳水基团组成。采用Predicting Anti-genic Peptides软件预测NoV VP2蛋白的抗原表位，结果显示VP2蛋白平均存在8个抗原决定簇；其中GⅡ.4 LN-2021-18毒株VP2蛋白存在9个抗原决定簇，即第4~23位、第41~57位、第81~88位、第146~152位、第161~171位、第184~193位、第216~223位、第230~240位和第253~259位，见表4。

表4 GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白抗原决定簇的预测结果Table 4 Prediction results of antigen determinants of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein

进一步采用ABCpred预测结果显示，NoV流行毒株VP2蛋白平均存在25个B细胞抗原表位；其中GⅡ.4 LN-2021-18存在26个B细胞抗原表位，分别为第110~125位、第171~186位、第240~255位等，具体表位及序列，见表5。

表5 GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白潜在B细胞抗原表位的预测结果Table 5 Prediction results of potential B cell epitopes of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein

4 讨论

本研究通过生物信息学方法对NoV GⅡ.4型流行毒株VP2蛋白的等电点进行预测，结果显示：VP2蛋白的平均等电点为10.47。等电点可以用来分离沉淀蛋白，相比于传统的等电点测定方法，生物信息学方法更加简便、快速[22]。VP2蛋白中含量最高的氨基酸是丝氨酸，其次是丙氨酸；预测所获得的VP2蛋白分子质量可用于VP2蛋白的分离和提纯。

蛋白质磷酸化可以将外源刺激转化为内源的信号，是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制[23]。随着蛋白质磷酸化研究的深入，生物信息学产生的数据已经成为磷酸化蛋白质组研究中重要的基础。与传统的磷酸化位点测定方法相比，生物信息学可以更快更方便的对蛋白磷酸化位点预测。本文结果发现NoV流行毒株VP2蛋白平均存在43个磷酸化位点（表2）。根据预测获得的VP2蛋白磷酸化位点可用于更深入的研究VP2蛋白对NoV的作用。此外有研究表明，病毒蛋白的磷酸化位点可能与其核定位信号和/或出核信号有关，这为研究NoV VP2蛋白的入核和出核提供了理论基础[24]。

之前的研究表明α-螺旋和β-折叠位于蛋白质内部，较难形成抗原决定簇[25]。其中α-螺旋还可以与刺突蛋白结合，从而进行病毒检测、中和抗体分析和治疗[26]。无规则卷曲多位于蛋白质外侧，可以折叠和扭转，因此无规则卷曲区域产生抗原决定簇的概率更高[27]。NoV流行毒株VP2蛋白二级结构预测结果显示，α-螺旋占比38.17%、延伸链占比7.45%、β转角占比6.25%、无规则卷曲占比48.13%。VP2蛋白无规则卷曲所占比例最高，这表示其产生抗原决定簇区域的概率也比较高。根据预测获得的VP2蛋白二级结构和三级结构可为NoV疫苗的开发提供基础。

B细胞主要介导体液免疫和细胞免疫，可以识别多种抗原和抗原裂解后的空间构象[28]。研究表明NoV疫苗可以诱导B细胞免疫反应，因此B细胞抗原表位的预测显得尤为重要[29]。使用ABCpred在线软件进行预测，得出NoV流行毒株VP2蛋白最优潜在B细胞抗原表位平均为25个。在目前的研究中，从NoV结构蛋白预测到与B细胞结合的抗原表位，发现可能与B细胞相互作用并启动免疫反应的潜在表位，以此诱导体液免疫和细胞免疫[30]。根据预测获得的B细胞抗原表位可为开发基于NoV VP2蛋白的疫苗提供依据。

NoV VP2蛋白的基本性质和其在病毒颗粒内部的位置决定了它能够与VP1蛋白相互作用而稳定病毒样颗粒，同时发现GⅡ.4 VP2蛋白会对病毒RdRp活性造成影响[31,32]。早期研究发现，VP2蛋白可以提高VP1蛋白的稳定性及其表达水平，并且通过免疫共沉淀等技术验证了VP2蛋白上第108~152个氨基酸可能是与VP1蛋白相互作用的位点[33,34]。利用酵母双杂交技术等实验表明了GⅡ.4 VP2蛋白与VP1蛋白在病毒进化中共存，且VP2蛋白序列的可变性可能是功能驱动的[35]。这些研究表明VP2蛋白在NoV中发挥着重要作用，对其进行生物信息学分析可以对NoV的预防提供一种新思路。

5 结论

本研究基于软件分析预测，当前NoV流行毒株GⅡ.4 VP2蛋白有如下特征：（1）为稳定的亲水性蛋白，平均等电点10.47、吸水系数-0.47、不稳定系数47.91、碱性氨基酸含量11.60%。（2）平均存在43个蛋白质磷酸化位点和2个糖基化位点；除GⅠ.3型NoV外，大多数毒株不存在跨膜蛋白和信号肽。（3）VP2蛋白二级结构主要形式平均含量分别为α-螺旋38.17%、延伸链7.45%、β转角6.25%、无规则卷曲48.13%；三级结构预测模型的蛋白覆盖率为56.70%；平均存在8个潜在的蛋白质抗原决定簇和25个B细胞抗原表位。本文预测的NoV流行毒株GII.4 VP2蛋白的理化性质为深入研究VP2蛋白功能提供理论参考，同时二级、三级结构和抗原表位的预测也为研制基于VP2蛋白的NoV疫苗提供理论基础。这为解决由NoV引起的食品安全问题提供了新的思路。