APP下载

GⅡ.4型诺如病毒VP2蛋白生物信息学分析

2023-10-10林鹏黄玉雯李学鹏励建荣

现代食品科技 2023年9期
关键词:表位糖基化毒株

林鹏,黄玉雯,李学鹏,励建荣

(渤海大学食品科学与工程学院,渤海大学海洋研究院,辽宁省食品安全重点实验室,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013)

诺如病毒(Norovirus,NoV)曾称诺瓦克病毒(Norwalk Viruses),隶属于杯状病毒科(Caliciviridae),诺如病毒属(Norovirus)成员,是一种单股正链RNA病毒。1968年美国俄亥俄州诺沃克市暴发了NoV感染,随后世界各地相继发现该病毒的其它亚型[1]。NoV基因组包含三个开放阅读框(Open Reading Frames,ORFs),其中ORF1编码非结构蛋白,ORF2编码衣壳蛋白(VP1),ORF3编码次要结构蛋白(VP2)[2]。近年来由于新的流行毒株出现,根据VP1蛋白的氨基酸序列和ORF1的RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)区的核苷酸多样性,分为不同的基因群和P群,进一步将NoV分为10个基因群(GI-GX)和不同的P型,其中GⅠ、GⅡ、GⅣ、GVIII和GIX基因群主要感染人类,被通称为人源诺如病毒(Human Norovirus,HuNoV)[3]。根据流行病学研究表示,HuNoV是引起流行性、自限性急性胃肠炎的主要病原体之一,约占所有急性胃肠炎病例的五分之一[4]。对健康的成人来说,NoV引起一种急性自限性的胃肠道感染;但在老年人、儿童和免疫功能低下的患者中NoV则会造成较高的发病率和死亡率[5]。NoV感染的主要传播为粪便-口途径,主要由于食用含有NoV的食品,以生食贝类或者食用加热不彻底的贝类最为常见[6]。全年均可发生,但多发生在秋冬季节[7]。自2013年以来,我国每年因NoV引起的急性胃肠炎病例逐年递增,其主要临床表现为腹泻和呕吐等[8]。NoV具有较强的感染性,且目前暂无特效药物。因此,由NoV引起的食品安全问题亟待关注。

NoV目前主要的流行毒株包括GⅠ.3、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.13和GⅡ.17型,这些基因型很容易产生新的突变,且新的突变型通常具有更强的传染性和变异性[9]。在过去的30年中,GⅡ.4型占据主导地位,导致了大约70% NoV的暴发[10]。有证据表明,每2~3年GⅡ.4型都会出现一种新的变异株[11]。目前GⅡ.4型主要有六种流行变异株,分别为Grimsby 1995、Farmington Hills 2002、Hunter 2004、Den Haag 2006b、New Orleans 2009和Sydney 2012[12]。

VP2蛋白作为NoV次要结构蛋白,可以和VP1蛋白组成NoVs病毒颗粒[13];然而,VP2蛋白对于病毒颗粒不是必需的,主要对病毒的稳定性和衣壳化起到非常重要的作用[14,15]。有研究表明,VP2蛋白和VP1蛋白相互作用可促进衣壳蛋白的表达,进而影响NoV的复制[16,17]。NoV VP2蛋白具有较高的突变性,在不同毒株的NoV可能起到不同的生物学作用[18]。

NoV已被公认为是最主要的病毒性胃肠病原体之一,影响着全世界各个年龄段的数亿人,造成每年全球直接经济损失为42亿美元,社会经济损失603亿美元[19,20]。因此,研究NoV具有非常重要的现实意义。但目前关于NoV流行毒株VP2蛋白研究相对较少,对其生物学作用了解不够全面,不能对NoV VP2蛋白的理化性质、蛋白结构等提供有效的参考[21]。本研究采用生物信息学对NoV流行毒株VP2蛋白结构与功能进行预测,为进一步研究VP2蛋白功能及开发亚单位疫苗提供理论支持,以此为解决由NoV引起的食品安全问题提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 毒株序列

GⅡ.4 LN-2021-18毒株VP2基因序列由本实验室分离病毒测序。

1.2 参考毒株序列

综上所述根据目前主要的NoV流行毒株,选取以下12株进行分析[9-12]。NoV GI.3 Nashville 2016毒株(GenBank:MK073893.1);NoV GⅡ.2 Japan 2020毒株(GenBank:LC646332.1);NoV GⅡ.3 AnnArbor 2016毒株(GenBank:MK073886.1);NoV GⅡ.4 Tokyo 2021毒株(GenBank:LC699541.1),NoV GⅡ.4 Sydney 2016毒株(GenBank:MK073885.1),NoV GⅡ.4 Sydney 2012毒株(GenBank:KU678201.1),NoV GⅡ.4 Johannesburg 2009毒株(GenBank:KP784691.1),NoV GⅡ.4 Den Haag 2006b毒株(GenBank:KM245071.1),NoV GⅡ.4 Hong Kong 2004毒株(GenBank:HM802551.1),NoV GⅡ.4 Houston 2002毒株(GenBank:EU310927.1);NoV GⅡ.13 USA 2010毒株(GenBank:JN899242.1);NoV GⅡ.17 CN 2014毒株(GenBank:KU757047.1)。

1.3 实验方法

1.3.1 VP2蛋白序列分析

使用MEGA 6.05软件对VP2蛋白的氨基酸序列进行分析比对,采用Neighbor-joining法构建VP2蛋白进化树。

1.3.2 VP2蛋白理化性质的预测

使用在线软件ProtParam Tool(https://web.expasy.org/protparam/)预测VP2蛋白的带电荷氨基酸数量、不稳定系数、平均吸水系数、相对分子质量、氨基酸组成及等电点;进一步使用ProtScale在线软件(https://web.expasy.org/protscale/)预测VP2蛋白的亲疏水性。

1.3.3 VP2蛋白磷酸化位点和糖基化位点的预测

在线软件NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测VP2蛋白的潜在磷酸化位点;在线软件NetOGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测VP2蛋白的潜在糖基化位点。

1.3.4 VP2蛋白跨膜区及信号肽的预测

在线软件TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测VP2蛋白的跨膜区;在线软件SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)预测VP2蛋白的信号肽。

1.3.5 VP2蛋白二级结构的预测

在线软件PSIRED Workbench(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测VP2蛋白的二级结构。

1.3.6 VP2蛋白三级结构的预测

使用在线软件Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi? id=index)建立VP2蛋白的空间构象,并进行高级结构的预测。

1.3.7 VP2蛋白潜在抗原表位的预测

在线软件Predicting Anti-genic Peptides(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl#:~:text=Ant igenic%20peptides%20are%20determined%20using%20 the%20method%20of,The%20reported%20accuracy%20 of%20 method%20is%20about%2075% 25.)预测VP2蛋白的抗原决定簇;使用在线软件ABCpred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/)预测VP2蛋白的潜在B细胞抗原表位。

1.4 数据分析

试验数据使用GraphPad Prism 7.0软件进行分析,结果以平均值表示。

3 结果分析

3.1 VP2蛋白进化树构建

进化树构建结果显示GⅡ.4 LN-2021-18与GⅡ.4 Sydney 2016毒株位于同一个小分支,亲缘关系最近;GⅠ.3 Nashville 2016、GⅡ.2 Japan 2020、GⅡ.3 AnnArbor 2016、GⅡ.13 USA 2010和GⅡ.17 CN 2014同属于一个大分支(图1)。

图1 NoV VP2蛋白的进化树分析结果Fig.1 Evolutionary tree analysis result of NoV VP2 protein

3.2 VP2蛋白的理化性质

使用ProtScale在线软件预测NoV流行毒株VP2蛋白的理化性质,结果显示NoV VP2蛋白均为亲水蛋白(图2);NoV VP2蛋白的平均等电点为10.47,平均吸水系数为-0.47,平均不稳定系数为47.91,碱性氨基酸平均含量为11.60%;其中GI.3 Nashville 2016毒株VP2蛋白的平均吸水系数、不稳定系数和碱性氨基酸含量较低,分别为-0.27、42.13和9.30%;GⅡ.17 CN 2014毒株VP2蛋白的不稳定系数较高为56.74。NoV流行毒株VP2蛋白具体理化性质(表1)。

表1 NoV流行毒株VP2蛋白的理化性质Table 1 Physicochemical properties of VP2 protein of NoV epidemic strains

图2 GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白的亲疏水性预测结果Fig.2 Hydrophobicity prediction results of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein

3.3 VP2蛋白磷酸化位点和糖基化位点

NetPhos 3.1 Server和NetOGlyc 1.0 Server分别预测VP2蛋白潜在的磷酸化位点和糖基化位点。结果显示,NoV VP2蛋白含有多个磷酸化位点(图3)和糖基化位点(图4)。NoV VP2蛋白潜在的磷酸化位点平均为43个和糖基化位点平均存在2个(表2);8种GⅡ.4亚型毒株在第20、92、132、160、163、167、175、180、184、190、193、199、209、219、225、226、228、229、230、235、244和266位存在共同丝氨酸位点,第71、94、114、124、176、194、222、236和251位存在共同苏氨酸位点,第116位存在共同酪氨酸位点;GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.13、GⅡ.17型毒株在第20、81、168和171位存在共同丝氨酸位点,第103和121位存在共同苏氨酸位点;GⅠ.3、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.13、GⅡ.17型毒株在第81位有共同丝氨酸位点。除GⅡ.4 Hong Kong 2004,其余7种GⅡ.4型毒株均在第171位存在糖基化位点。

表2 NoV流行毒株VP2蛋白的磷酸化位点和糖基化位点Table 2 Phosphorylation sites and glycosylation sites of VP2 protein of NoV epidemic strains

图3 GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白磷酸化位点预测结果Fig.3 Prediction results of phosphorylation sites of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein

图4 GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白糖基化位点预测结果Fig.4 Prediction results of glycosylation sites of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein

3.4 VP2蛋白跨膜区及信号肽的预测

TMHMM Server v.2.0和SignalP5.0 Server在线软件分别预测VP2蛋白是否存在跨膜区和信号肽。结果显示,大多数NoV流行毒株VP2蛋白无跨膜区和信号肽(图5a和图6a);然而GⅠ.3毒株VP2蛋白有跨膜区和信号肽(图5b和图6b)。

图5 VP2蛋白跨膜结构域预测结果Fig.5 Prediction results of transmembrane domain of VP2 protein

图6 VP2蛋白信号肽预测结果Fig.6 Prediction results of signal peptide of VP2 protein

3.5 VP2蛋白二级结构的预测

采用PSIPRED软件预测NoV流行毒株VP2蛋白二级结构主要形式,结果分析发现所有VP2蛋白结构相似(图7);同时利用SOPMA预测VP2蛋白二级结构主要形式的含量,预测结果显示NoV流行毒株VP2蛋白中α-螺旋(蓝色)平均占比38.17%、延伸链(红色)平均占比7.45%、β转角(绿色)平均占比6.25%、无规则卷曲(紫色)平均占比48.13%(图8和表3);进一步分析发现GⅠ.3 Nashville 2016毒株VP2蛋白以α-螺旋为主,其余12种蛋白均以无规则卷曲为主。无规则卷曲较为松散且易发生扭曲盘旋并暴露在蛋白质表面,较易成为抗原表位。

表3 NoV流行毒株VP2蛋白的二级结构Table 3 Secondary structure results of VP2 protein of NoV epidemic strains

图7 PSIPRED软件预测的GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白的二级结构Fig.7 Secondary structure results of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein measured on PSIPRED software

图8 SOPMA软件预测的GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白的二级结构Fig.8 Secondary structure results of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein measured on SOPMA software

3.6 VP2蛋白三级结构的预测

通过在线网站Phyre2对NoV流行毒株VP2蛋白的三级结构分析。预测结果发现VP2蛋白最高的置信度为56.70%,蛋白质的覆盖率为10%。其中GⅡ.3毒株、GⅡ.4 Tokyo 2021毒株、GⅡ.4 Hong Kong 2004毒株、GⅡ.4 Sydney 2016毒株和GⅡ.4 LN-2021-18毒株相似(图9a);GⅠ.3毒株、GⅡ.13毒株和GⅡ.17毒株相似(图9b);GⅡ.2毒株(图9c);GⅡ.4 Houston 2002毒株和GⅡ.4 Johannesburg 2009毒株相似(图9d);GⅡ.4 Den Haag 2006b毒株和GⅡ.4 Sydney 2012毒株相似(图9e)。

图9 VP2蛋白三级结构空间模型预测结果Fig.9 Prediction results of tertiary structure spatial model of VP2 protein

3.7 VP2蛋白潜在抗原表位的预测

抗原决定簇是蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域,一般由6~12个氨基酸或碳水基团组成。采用Predicting Anti-genic Peptides软件预测NoV VP2蛋白的抗原表位,结果显示VP2蛋白平均存在8个抗原决定簇;其中GⅡ.4 LN-2021-18毒株VP2蛋白存在9个抗原决定簇,即第4~23位、第41~57位、第81~88位、第146~152位、第161~171位、第184~193位、第216~223位、第230~240位和第253~259位,见表4。

表4 GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白抗原决定簇的预测结果Table 4 Prediction results of antigen determinants of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein

进一步采用ABCpred预测结果显示,NoV流行毒株VP2蛋白平均存在25个B细胞抗原表位;其中GⅡ.4 LN-2021-18存在26个B细胞抗原表位,分别为第110~125位、第171~186位、第240~255位等,具体表位及序列,见表5。

表5 GⅡ.4 LN-2021-18 VP2蛋白潜在B细胞抗原表位的预测结果Table 5 Prediction results of potential B cell epitopes of GⅡ.4 LN-2021-18 VP2 protein

4 讨论

本研究通过生物信息学方法对NoV GⅡ.4型流行毒株VP2蛋白的等电点进行预测,结果显示:VP2蛋白的平均等电点为10.47。等电点可以用来分离沉淀蛋白,相比于传统的等电点测定方法,生物信息学方法更加简便、快速[22]。VP2蛋白中含量最高的氨基酸是丝氨酸,其次是丙氨酸;预测所获得的VP2蛋白分子质量可用于VP2蛋白的分离和提纯。

蛋白质磷酸化可以将外源刺激转化为内源的信号,是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍,也是最重要的机制[23]。随着蛋白质磷酸化研究的深入,生物信息学产生的数据已经成为磷酸化蛋白质组研究中重要的基础。与传统的磷酸化位点测定方法相比,生物信息学可以更快更方便的对蛋白磷酸化位点预测。本文结果发现NoV流行毒株VP2蛋白平均存在43个磷酸化位点(表2)。根据预测获得的VP2蛋白磷酸化位点可用于更深入的研究VP2蛋白对NoV的作用。此外有研究表明,病毒蛋白的磷酸化位点可能与其核定位信号和/或出核信号有关,这为研究NoV VP2蛋白的入核和出核提供了理论基础[24]。

之前的研究表明α-螺旋和β-折叠位于蛋白质内部,较难形成抗原决定簇[25]。其中α-螺旋还可以与刺突蛋白结合,从而进行病毒检测、中和抗体分析和治疗[26]。无规则卷曲多位于蛋白质外侧,可以折叠和扭转,因此无规则卷曲区域产生抗原决定簇的概率更高[27]。NoV流行毒株VP2蛋白二级结构预测结果显示,α-螺旋占比38.17%、延伸链占比7.45%、β转角占比6.25%、无规则卷曲占比48.13%。VP2蛋白无规则卷曲所占比例最高,这表示其产生抗原决定簇区域的概率也比较高。根据预测获得的VP2蛋白二级结构和三级结构可为NoV疫苗的开发提供基础。

B细胞主要介导体液免疫和细胞免疫,可以识别多种抗原和抗原裂解后的空间构象[28]。研究表明NoV疫苗可以诱导B细胞免疫反应,因此B细胞抗原表位的预测显得尤为重要[29]。使用ABCpred在线软件进行预测,得出NoV流行毒株VP2蛋白最优潜在B细胞抗原表位平均为25个。在目前的研究中,从NoV结构蛋白预测到与B细胞结合的抗原表位,发现可能与B细胞相互作用并启动免疫反应的潜在表位,以此诱导体液免疫和细胞免疫[30]。根据预测获得的B细胞抗原表位可为开发基于NoV VP2蛋白的疫苗提供依据。

NoV VP2蛋白的基本性质和其在病毒颗粒内部的位置决定了它能够与VP1蛋白相互作用而稳定病毒样颗粒,同时发现GⅡ.4 VP2蛋白会对病毒RdRp活性造成影响[31,32]。早期研究发现,VP2蛋白可以提高VP1蛋白的稳定性及其表达水平,并且通过免疫共沉淀等技术验证了VP2蛋白上第108~152个氨基酸可能是与VP1蛋白相互作用的位点[33,34]。利用酵母双杂交技术等实验表明了GⅡ.4 VP2蛋白与VP1蛋白在病毒进化中共存,且VP2蛋白序列的可变性可能是功能驱动的[35]。这些研究表明VP2蛋白在NoV中发挥着重要作用,对其进行生物信息学分析可以对NoV的预防提供一种新思路。

5 结论

本研究基于软件分析预测,当前NoV流行毒株GⅡ.4 VP2蛋白有如下特征:(1)为稳定的亲水性蛋白,平均等电点10.47、吸水系数-0.47、不稳定系数47.91、碱性氨基酸含量11.60%。(2)平均存在43个蛋白质磷酸化位点和2个糖基化位点;除GⅠ.3型NoV外,大多数毒株不存在跨膜蛋白和信号肽。(3)VP2蛋白二级结构主要形式平均含量分别为α-螺旋38.17%、延伸链7.45%、β转角6.25%、无规则卷曲48.13%;三级结构预测模型的蛋白覆盖率为56.70%;平均存在8个潜在的蛋白质抗原决定簇和25个B细胞抗原表位。本文预测的NoV流行毒株GII.4 VP2蛋白的理化性质为深入研究VP2蛋白功能提供理论参考,同时二级、三级结构和抗原表位的预测也为研制基于VP2蛋白的NoV疫苗提供理论基础。这为解决由NoV引起的食品安全问题提供了新的思路。

猜你喜欢

表位糖基化毒株
H3N2流感病毒HA保守Th表位对CD4+T细胞活化及分化的影响
法国发现新冠新变异毒株IHU
糖基化燕麦分离蛋白制备的工艺优化研究
联合T、B细胞表位设计多肽疫苗的研究进展①
广西鸭圆环病毒流行毒株遗传变异分析
小反刍兽疫病毒化学合成表位多肽对小鼠的免疫效果研究
结核分枝杆菌抗原Lppx和MT0322人T细胞抗原表位的多态性研究
糖基化终末产物与冠脉舒张功能受损
牛传染性鼻气管炎IBRV/JZ06-3基础毒株毒力返强试验
猪瘟强毒株与兔化弱毒疫苗株的LAMP鉴别检测