安 静，肖珩玥，贺彰瑾，鲁理平

（北京工业大学 环境科学系，北京 100124）

抗生素在生态系统中的持续积累已造成严重的环境危害，抗生素滥用引起了全世界的广泛关注［1-2］。抗生素的不当和过度使用导致其在环境和食品样本中积累［3］。氯霉素（CAP）是一种高效的广谱抗生素，被广泛用于治疗动物及人体受到的各种敏感菌感染［4］。然而，异常摄入CAP 可导致一系列严重的环境危害，造成动物和人体内的抗生素残留，对造血系统产生严重的毒副作用，如再生障碍性贫血和白血病等［5］。因此，开发准确、快速检测痕量CAP的方法具有重要意义。

传统的CAP 检测方法侧重于高效液相色谱（HPLC）［6］、气相色谱-质谱（GC-MS）［7］、液相色谱-质谱（LC-MS）［8］和酶联免疫吸附法（ELISA）［9］。然而，上述技术在大型仪器、复杂操作和技术人员上的要求限制了其在简单快速监测中的应用［10］。近年来，基于免疫反应［11-12］和适配体化学［13-14］的电化学传感技术在CAP 快速、灵敏检测中受到了广泛关注。核酸适配体是指通过指数富集配体系统进化技术（SELEX），在随机寡核苷酸序列的文库中筛选得到的能与各种目标物进行高亲和力、高特异性识别的单链DNA 或RNA 分子［15-16］。与传统方法相比，由于适配体易于修饰且与靶标具有高亲和力及高结合力，基于适配体构建的氯霉素生物传感器具有更高的准确性和稳定性以及更低的检出限。量子点（QDs）一般由无机核和存在于核表面的有机基团组成，是由少量原子组成的准零维半导体纳米微晶体［17-18］。与传统发光材料相比，量子点的激发光谱较宽且发射光谱较窄，具有较小尺寸的粒径和易于功能化的表面，基于此特性，其成为具有新兴价值的发光体之一［19-20］。然而，选择合适的载体材料将量子点固定在电极表面是制备传感器的重要环节。由于氧化石墨烯（GO）较大的比表面积和良好的生物相容性被广泛用于生物传感器研制［21-23］。

本文合成了量子点-氧化石墨烯纳米复合材料（GO-QDs），并以其为基本单位制备适配体电化学发光（ECL）传感器。修饰氨基基团的cDNA 与量子点表面的羧基通过酰胺键将cDNA 结合至电极表面。利用氯化血红素（Hemin）可插入双链DNA 碱基对中的独特性质及其过氧化物酶的特性造成共反应剂过氧化氢的消耗，从而引起传感器的电化学发光信号变化。当CAP 存在时，由于与适配体结合致使双链DNA（dsDNA）解旋，即氯化血红素远离电极表面，电极的电化学发光信号得以恢复，达到特异性检测靶标的目的。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

牛血清白蛋白（BSA）、氯化镉、巯基丙酸（MPA）、硫代硫酸钠、氧化石墨烯粉末均购于百灵威科技有限公司。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、氢氧化钠均购于天津福晨化学试剂厂；聚（二烯丙基二甲基氯化铵）（PDDA）购自美国Sigma-Aldrich 公司；乙基-（3-二甲基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购于国药集团化学试剂有限公司；实验用水为超纯水（美国Milli-Q 公司，18．2 MΩ·cm）。所用DNA序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成纯化，序列如下［24］：

Apt DNA：5'-CAA TAA GCG ATG CGC CCT CGC CTG GGG GCC TAG TCC TCT CCT ATG CGT GCT ACC GTG AA-3’。

cDNA：5'-NH2-CAT CGC TTA TTG AAA AA AAA AA-3’。

实验仪器：ECL 分析仪（MPI-E，西安瑞玛电子科技有限公司）、电化学分析仪（CHI 660a，上海辰华仪器有限公司）、F-4600 荧光光谱仪（日本日立公司）、JEM 2011 透射电子显微镜（JEOL 有限公司）、UV-2450型紫外-可见吸收光谱仪（日本岛津公司）。

1.2 CdS量子点的合成及GO-QDs复合物的制备

按照参考文献，利用一步水浴加热法合成CdS 量子点［25］。将MPA 滴加到20 mmol/L 氯化镉水溶液中，持续搅拌并用NaOH溶液将pH值调至10．0。在氮气环境中，加入硫代乙酰胺并保持持续机械搅拌状态，加热至80 °C并使其冷凝回流4 h以上，直至观察到亮黄色的硫化镉量子点，将其置于4 ℃储存备用。

依据参考文献制备GO-QDs 复合材料［25-26］：将氧化石墨烯粉末在水溶液中超声分散至形成分布均匀的GO 悬浊液（1 mg/mL）。取GO 悬浊液与17．2%的PDDA 溶液超声混匀，在12 000 r/min 下离心20 min 后，用水洗涤至少3 次，以去除多余的PDDA。将离心后的GO-PDDA 沉淀分散到CdS QDs 悬浊液中，通过静电吸附作用使CdS QDs和PDDA结合。将所得混合溶液在室温下搅拌24 h，形成GO-QDs纳米复合材料。最后将所得的复合材料离心20 min，并用水洗涤分散在水中，4 ℃下储存备用。

1.3 电极预处理

将玻碳电极（GCE）进行预处理，依次用0．3 μm和50 nm粒径的Al2O3打磨电极呈镜面状态，之后依次用水、乙醇、水超声清洗，用氮气吹干备用。

1.4 适配体传感器的制备

CAP电化学发光传感器的构建过程如图1所示。首先取10 μL混合均匀的GO-QDs纳米复合材料滴涂于玻碳电极表面，此电极记为GO-QDs/GCE。之后将电极浸泡在含0．01 mol/L EDC 和0．005 mol/L NHS的混合溶液中，以获得羧基化的量子点。在GO-QDs/GCE 表面滴加10 μL cDNA于湿润环境中在室温下孵育2 h，cDNA 修饰的氨基与量子点表面的羧基形成酰胺键，从而固载到电极表面，此电极记为cDNA/GO-QDs/GCE。随后取10 μL Apt DNA滴至电极表面并于湿润环境中在室温下孵育8 h，形成双链结构，此时记为dsDNA/GO-QDs/GCE。将电极浸入1% BSA 溶液中，在37 ℃恒温条件下孵育60 min 以封闭剩余的未结合位点。最后孵育10 μmol/L 的Hemin 溶液90 min，电极记为hemin-dsDNA/GO-QDs/GCE。

图1 氯霉素适配体电化学发光传感器的构建过程及原理Fig．1 Construction process and principle of chloramphenicol aptamer electrochemiluminescence sensor

1.5 氯霉素的检测

将上述修饰电极浸入不同浓度的CAP溶液避光孵育120 min，用5 mmol/L PBS溶液充分洗涤，将未结合的CAP、CAP 与Apt DNA 的复合物以及脱落的氯化血红素彻底冲洗干净，测定电化学发光信号。测量参数为：在-1．5～0 V的电位范围内以100 mV/s扫描，光电倍增管电压设置为600 V。

2 结果与讨论

2.1 CdS QDs与GO-QDs的表征

硫化镉量子点（CdS QDs）的透射电子显微镜图如图2A 所示，从图中可明显观察到量子点的单位粒径大小约为1～2 nm，分散性良好，呈现明显的晶格状条纹，形状为球形或近球形。CdS QDs的紫外-可见吸收光谱及荧光光谱如图2B 所示，其最大紫外吸收峰波长为379 nm，最大荧光峰值出现在570 nm（λex=370 nm）。将结果代入Yu等［27］提出的经验公式：

图2 CdS QDs的透射电镜图（A）、紫外-可见吸收光谱和荧光光谱图（B）以及GO-QDs的透射电镜图（C）Fig．2 Transmission electron microscope diagram of CdS QDs（A），ultraviolet-visible absorption spectrum and fluorescence spectrum（B） and the transmission electron microscope of GO-QDs（C）

其中D为直径，将最大紫外吸收峰波长λmax=379 代入，计算得到CdS QDs 的直径约为1．36 nm，与其透射表征结果相符。由氧化石墨烯-量子点（GO-QDs）的透射电镜图（图2C）可见，基于层与层之间的电子排斥作用，GO 呈现薄纱形态和褶皱状纹理。同时，大量量子点已负载到GO 表面，证明上述实验成功合成了GO-QDs复合物。

2.2 传感器的电化学表征

采用电化学阻抗（EIS）法分别对传感器的修饰过程进行了各界面的性质分析［28］。如图3所示，阻抗谱图中的半圆直径数值可表征界面的电子传递性能，修饰GO-QDs 纳米复合材料的电极阻抗（曲线B）小于裸GCE（曲线A），说明GO-QDs 复合材料具有较高的电子转移能力。当电极表面分别修饰cDNA（曲线C）和Apt DNA（曲线D）时，带负电荷的DNA 磷酸骨架对阴离子（［Fe（CN）6］3-/4-）的静电排斥作用致使阻抗逐步增大。当修饰电极与靶标物CAP孵育后，由于适配体与氯霉素的结合使DNA双螺旋结构解旋，并脱离电极表面，阻抗明显减小（曲线E）。实验结果表明，该传感器的制备方法是可行的。

图3 修饰电极在5 mmol/L［ Fe（CN）6］3-/4（-0．1 mol/L KCl）溶液中的阻抗图Fig．3 Impedance diagrams of the modified electrodes in 5 mmol/L［ Fe（CN）6］3-/4（-0．1 mol/L KCl） solution A：bare GCE；B：GO-QDs/GCE；C：cDNA/GO-QDs/GCE；D：ds-DNA/GO-QDs/GCE；E：CAP/hemin-dsDNA/GO-QDs/GCE

2.3 实验条件的优化

本传感器的检测信号变化基于体系中共反应剂H2O2的消耗量，所以嵌入双链DNA 中的氯化血红素是关键因素。为获得最优条件，考察了氯化血红素的浓度对修饰电极电化学发光强度的影响（图4A）。如图所示，随着氯化血红素浓度的增大，电化学发光信号快速减小，当其浓度达到10 μmol/L 时，电化学发光信号趋于稳定，因此选择浓度为10 μmol/L 的氯化血红素溶液。同时对氯化血红素的孵育时间（30、60、90、120、150 min）进行了优化，如图4B 所示，随着孵育时间的增加，电化学发光信号逐渐降低，并在120 min 后趋于稳定，因此选择最佳孵育时间为120 min。另外考察了cDNA 在电极表面的最佳孵育时间，如图4C 所示，电化学发光信号随着反应时间的增加而逐渐减小，当反应时间为120 min 时，电化学发光信号强度不再变化，因此选择cDNA的孵育时间为120 min。

图4 氯化血红素浓度（A）及孵育时间（B） 和cDNA孵育时间（C）对电化学发光强度的影响Fig．4 Effect of hemin concentration（A），hemin incubation time（B） and cDNA incubation time（C）on the electrochemiluminescence intensity

2.4 氯霉素的检测性能

在最佳实验条件下，考察了电化学发光信号与CAP 浓度的线性关系。如图5 所示，传感器的电化学发光强度随着CAP 浓度的增加而增加，通过测量差值ΔI=Ip-I0分析其检测性能（其中，I0为传感器在空白溶液中的ECL 强度，Ip为CAP 溶液中的ECL 强度）。结果表明，ΔI与CAP 浓度的对数在1．0×10-10～1．0×10-6mol/L范围内呈良好的线性关系，检出限（LOD）为3×10-11mol/L。

图5 适配体传感器对不同浓度CAP的ECL响应曲线Fig．5 ECL response curves of aptamer sensor to different concentrations of CAP CAP concentration（a-e）：1．0×10-10，1．0×10-9，1．0×10-8，1．0×10-7，1．0×10-6 mol/L

2.5 生物传感器的选择性、稳定性与重现性

特异性是评价生物传感器检测性能的重要指标之一。考察了链霉素、卡那霉素、土霉素、四环素对测量结果可能产生的干扰影响。在保持其他条件一致时，利用生物传感器测量0．1 μmol/L 的CAP，其中包含100 μmol/L 的干扰物质。如图6A 所示，干扰物的影响不超过6%，说明该传感器对CAP 有很高的特异性。为验证传感器的稳定性，进行了10 个周期的连续循环电位扫描，可以观察到ECL 强度比较稳定（图6B）。同时考察了传感器的重现性，在相同条件下制备了5 支传感器，采用上述传感器分别测量1．0×10-7mol/L的CAP，其ECL强度的相对标准偏差（RSD）为5．6%，表明传感器的重现性良好。

图6 干扰物对CAP的ECL响应的影响（A），以及生物传感器连续扫描10圈的ECL响应-时间曲线图（B）Fig．6 Effect of other antibiotics on the electrochemiluminescence intensity of CAP at the sensor（A），and ECL intensity-time curve of continuous scanning for 10 cycles of the biosensor（B）

2.6 实际样品分析

将本文制备的电化学ECL 传感器用于实际样品中CAP 的检测，从超市选取某品牌的纯牛奶，用5 mmol/L 的PBS 缓冲溶液将牛奶稀释后采用本传感器进行检测和加标回收实验，每组选择3 个平行样，结果如表1所示。实际样品的回收率为99．8%～101%，RSD 为1．1%～4．5%，表明该传感器可用于实际样品分析。

表1 实际样品的检测结果Table 1 Detection results of real samples

3 结 论

本文利用PDDA 的正电性，以氧化石墨烯为载体制备了GO-QDs 纳米复合材料，实验结果表明该复合材料具有良好的导电性和稳定性。通过将cDNA 与apt DNA 杂交形成双链DNA 并与氯化血红素结合作为检测探针，构建了电化学发光适配体传感器。利用氯化血红素过氧化物酶的作用与H2O2反应，消耗共反应剂H2O2，使发光体量子点的发光强度减小。当CAP 存在时，双链解旋导致氯化血红素远离电极表面，电化学发光信号恢复。该方法具有灵敏度高、特异性好等优点，可用于实际样品中CAP 的快速测定。