曹小青，曾 丽，黄 静，韦思思，佟海滨，张 旭，吴明江*，杨 越*

（1．温州大学 生命与环境科学学院，浙江 温州 325035；2．浙江省水环境与海洋生物资源保护重点实验室，浙江 温州 325035）

羊栖菜是一种隶属于马尾藻科的食用褐藻，是韩国、日本和中国沿海居民的传统美食［1］。羊栖菜与紫菜、海带和裙带菜同属我国四大经济海藻［2］。与其它3种海藻的不同之处在于，羊栖菜不仅可以用作食材，还是一味具有悠久历史的中草药［3-4］，文献报道其具有补血、降血压、软坚化痰等功效［5-7］。多糖、多酚、总黄酮和岩藻黄质等是羊栖菜的主要活性成分，均具备良好的抗氧化活性［6-7］。此外，羊栖菜还具有抗肿瘤、抗肥胖、消炎及降血脂等活性作用［8-9］。由于具备较高的营养和药用价值，羊栖菜在食品、医药和护肤品等领域具有广阔的发展前景［10］。不同的生长环境如温度、光照、盐度和潮汐等因素会直接影响羊栖菜抗氧化物质的积累及抗氧化活性，从而导致羊栖菜品质存在明显差异。基于健康和经济方面的考虑，食品品质日益受到消费者和经销商的关注。因此，非常有必要对羊栖菜的抗氧化活性进行评价以保证羊栖菜的品质和保护消费者的利益。目前常见的抗氧化活性的测定方法有紫外-可见分光光度法［10-11］、化学发光法［12-13］和高效液相色谱法［14］。然而这些分析方法往往存在测定耗时、操作过程繁琐、实验技能要求较高、使用的有机试剂污染环境等缺点。因此，亟需建立一种快速、简便、准确的羊栖菜抗氧化活性分析方法，以提升羊栖菜品质控制水平，丰富其质量评价体系。

近红外光谱技术（Near-infrared spectroscopy，NIRS）是光谱技术结合化学计量学方法和计算机技术的一种间接高新分析技术，具有快速、简便、绿色、多组分同时测定和可实现在线分析等优点［15-16］，现已被广泛应用于食品、农业、医药、烟草、石油化工等众多领域［17-19］。目前已有少量研究报道了NIRS 在车厘子、藜麦等食品抗氧化活性测定方面的应用［20-22］，然而其在可食用海藻相关方面的应用尚未见报道。NIRS因具有简单快速、不污染环境、测定成本低和样品无需预处理等优点，已被证实可以作为传统体外抗氧化活性测定方法的替代方法，具有广阔的应用前景。目前，尚未发现基于NIRS对羊栖菜抗氧化活性定量分析的研究报道，羊栖菜抗氧化活性定量模型的建立将为羊栖菜的品质提升和开发利用提供一定的借鉴，从而提高羊栖菜的营养价值和经济价值，并为NIRS应用于海藻质量评价提供理论依据和应用支持，丰富和发展海藻质量评价的方法体系。

本研究采用NIRS 和偏最小二乘法（PLS）构建定量校正模型，并通过光谱预处理方法和变量选择方法优化模型性能，建立了一种快速、简便、准确的羊栖菜抗氧化活性分析方法，可在维护羊栖菜市场秩序、提升羊栖菜品质控制水平、推动我国羊栖菜产业的稳定持续发展方面提供帮助。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、过硫酸钾、三吡啶三吖嗪、七水合硫酸亚铁、无水醋酸钠（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）；冰醋酸、浓盐酸（分析纯，浙江中星化工试剂有限公司）；六水合三氯化铁、无水乙醇（分析纯，广东西陇科学股份有限公司）；实验用水均为去离子水（美国Millipore）。

羊栖菜，采集于浙江省洞头市羊栖菜养殖基地，采集时间分别为2020年12月11日、2021年1月9日、2021 年2 月1 日、2021 年3 月5 日、2021 年4 月4 日、2021 年4 月19 日。每批在同一生长海域采集外观、长短一致的25个羊栖菜样本。

1.2 仪器与设备

Binder 恒温鼓风干燥机（上海合测实业公司）；Antaris Ⅱ傅里叶变换近红外光谱仪（美国Thermo Fisher 公司）；TU1810 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；JP-040S 超声清洗机（深圳洁盟清洗设备有限公司）；CT15RT 型高速冷冻离心机（上海天美生化仪器设备工程公司）；OSB-2200水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）；800Y高速多功能粉碎机（永康铂欧五金制品有限公司）；SQP型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.3 近红外光谱的采集

羊栖菜用流动水清洗干净，置于恒温鼓风干燥机中于80 ℃下干燥4．5 h 至恒重。将干燥羊栖菜粉碎，过80 目筛网，每批得到25 份粒度均匀的羊栖菜粉末，6 批共计150 份羊栖菜粉末。取每份羊栖菜粉末样本平铺于样品杯中，以空气为参比，漫反射扫描模式，光谱扫描范围为4 000～10 000 cm-1，扫描次数为64次，分辨率为8 cm-1，每个样本扫描3次，取平均光谱用于后续数据处理。

1.4 抗氧化活性的测定

1.4.1 羊栖菜提取液的制备

精密称取羊栖菜粉末50 mg于50 mL容量瓶中，用去离子水定容，于室温在超声清洗机功率240 W下超声20 min，取出，3 000 r/min离心10 min，所得上清液即为羊栖菜提取液，于冰箱4 ℃保存。

1.4.2 测定DPPH自由基清除能力

参考Guo 等［23］的实验方法并进行调整，将样品溶液（2 mL）与DPPH 的乙醇溶液（0．1 mmol/L）2 mL（A1）或乙醇溶液2 mL（A2）混合，摇匀，室温下避光反应30 min。以去离子水（2 mL）与DPPH的乙醇溶液（2 mL）混合作为对照（A0），在517 nm处测定每种混合溶液的吸光度。每个样品一式3份，清除率计算如下：

其中A0为对照组的吸光度，A1为样品溶液混合DPPH乙醇溶液的吸光度，A2为样品溶液与乙醇混合溶液的吸光度。

1.4.3 测定ABTS自由基清除能力

采用Muhammad等［24］的实验方法，并进行调整。将ABTS水溶液（7 mmol/L）100 mL和过硫酸钾溶液（140 mmol/L）1．76 mL 置棕色瓶中，混合均匀，于黑暗室温环境中静置12 h 得ABTS 母液。将ABTS 母液用去离子水稀释至734 nm 处的吸光度为0．70±0．02，即得到ABTS 工作液。然后，将样品溶液（200 μL）与ABTS 工作液4 mL（A1）或去离子水4 mL（A2）混合，室温避光静置30 min。以去离子水（200 μL）为对照（A0），在734 nm处测定每种混合溶液的吸光度。每个样品一式3份，清除率由式（1）计算。式中A0为对照组的吸光度，A1为样品溶液混合ABTS 工作液的吸光度，A2为不含ABTS 工作液的样品溶液的吸光度。

1.4.4 铁离子还原能力测定（FRAP法）

1.4.4.1 样品溶液的测定参考Guan等［25］的方法进行FRAP 法测定。将醋酸缓冲液（300 mmol/L，pH 3．6）100 mL、三吡啶三吖嗪-盐酸溶液（10 mmol/L）10 mL、三氯化铁溶液（20 mmol/L）10 mL 混合制备FRAP工作液，37 ℃水浴备用。然后，将样品溶液（400 μL）与FRAP工作液（3．6 mL）混合，室温暗处静置30 min。以去离子水（400 μL）作为空白，在593 nm 处测定吸光度，每个样品平行制备3 份。铁离子还原能力以硫酸亚铁浓度（μmol/L）表示。

1.4.4.2 标准曲线的绘制精确称取七水合硫酸亚铁0．013 9 g 于容量瓶中，加去离子水溶解定容，即得1 000 μmol/L 的硫酸亚铁溶液。配制0、50、100、200、300、400、500 μmol/L 的硫酸亚铁溶液，精密移取不同浓度的硫酸亚铁溶液0．4 mL于试管中，加入预热到37 ℃的FRAP工作液3．6 mL，避光静置30 min，于593 nm 波长处测定吸光度。以吸光度（Y）为纵坐标，硫酸亚铁浓度（X，μmol/L）为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程为Y= 0．001 7X+ 0．000 5，r2= 0．999 5，线性关系良好。

1.4.5 紫外-可见分光光度法方法学验证

1.4.5.1 精密度实验按照DPPH、ABTS和FRAP 方法连续测定6次样品吸光度，各成分的相对标准偏差（RSD）分别为0．11%、0．080%、0．35%，均小于5．0%，精密度良好［26］。

1.4.5.2 重复性实验平行制备6份样品，分别测定其DPPH、ABTS和FRAP 抗氧化活性，各成分的RSD值分别为1．5%、2．9%、1．1%，均小于5．0%，重复性良好。

1.4.5.3 稳定性实验取同一样品，在1 h 内测定其DPPH、ABTS 和FRAP 抗氧化活性，各成分的RSD值分别为2．3%、1．3%、3．5%，均小于5．0%，样品在1 h内稳定性良好。

1.5 数据处理及模型性能评价

采用TQ Analyst 软件进行异常光谱的识别和光谱预处理方法的选择，建模变量选择采用MATLAB 2014a 软件，制表软件为Word 2019，数据统计使用Excel 2019 软件，绘图软件为Origin 2021。模型性能评价参数通常包括校正集相关系数（RC）、校正集均方根误差（RMSEC）、预测集相关系数（RP）和预测集均方根误差（RMSEP）。通常RC和RP越接近于1，RMSEC 和RMSEP 越小且越接近表明模型预测性能越高。

2 结果与讨论

2.1 近红外光谱分析

图1A 为羊栖菜在4 000～10 000 cm-1的近红外原始光谱图。可以看出，所有样本的近红外光谱变化趋势基本一致。图1中5 155 cm-1和6 944 cm-1处有两个明显的吸收峰，归属于水分子O—H 伸缩振动的组合频和一级倍频。其他较强吸收主要位于4 288、4 389、5 774、8 230 cm-1附近，4 288、4 389 cm-1处的吸收谱带归属于C—H 和—CH2伸缩和弯曲振动的组合频；5 774 cm-1处的峰与C—H 伸缩振动的一级倍频有关；8 230 cm-1处为C—H 伸缩振动的二级倍频［27］。采用马氏距离法识别DPPH 模型的异常光谱（图1B），可将异常光谱排除在阈值（虚线）之外。对于DPPH、ABTS 和FRAP 3 个抗氧化指标，分别检测出5、5和6个异常光谱。最终，DPPH、ABTS和FRAP的建模样本数分别为145、145和144。

图1 羊栖菜近红外原始光谱图（A）和DPPH模型异常光谱判别图（B）Fig．1 Raw NIR spectra of Sargassum fusiforme（A） and discrimination of anomalous spectra for DPPH model（B）

2.2 校正集与预测集划分

合理评价模型性能需要将样本划分为校正集和预测集，分别用于构建和验证校正模型。本实验采用浓度梯度法选取3/4的样本作为校正集，剩余1/4样本作为预测集。总样本集、校正集和预测集样本中参考值的数据统计结果见表1。可以看出，对于3种抗氧化活性指标，校正集和预测集样本的平均值和标准偏差均十分接近，并且校正集样本参考值的范围涵盖了预测集的范围，说明校正集与预测集的划分合理，有助于建立稳定的校正模型。

表1 样本的数据统计结果Table 1 Statistics results of samples

2.3 光谱预处理方法的选择

近红外光谱重叠严重，光谱易受到噪声、基线漂移、信号本底、光散射以及样品颗粒不均匀等带来的干扰［28-30］。因此有必要对原始光谱进行预处理，提高模型的稳健性和预测性能。

本研究采用表2 中的4 种光谱预处理方法对原始光谱数据进行优化：一阶导数结合Savitzky-Golay平滑（1D+SG）、二阶导数结合Savitzky-Golay 平滑（2D+SG）、多元散射校正（MSC）和标准正态变换（SNV），其中SG平滑的窗口宽度为5，多项式次数为2。使用1D+SG、2D+SG、MSC和SNV方法可以分离重叠峰、消除光谱散射效应和基线漂移。表2 中粗体表示最佳光谱预处理方法下的建模结果，可以发现，DPPH、ABTS和FRAP 模型均在选择1D+SG 光谱预处理方法时RMSEP 最小，分别为2．65、0．89和3．54。由于近红外光谱中包含大量冗余信息，且波长变量数过多，需要通过变量选择算法来选择关键变量。竞争性自适应重加权采样（CARS）算法是一种多变量优化方法，特别适用于高维数据的变量选择。与其他方法相比，CARS利用指数衰减函数（EDF）去除回归系数绝对值较小的波长，可有效避免过拟合风险［31］。后续基于1D+SG 预处理后的光谱数据分别建立DPPH、ABTS 和FRAP 的Full-PLS 模型和CARS-PLS模型，并比较其预测效果。

表2 不同光谱预处理方法的建模结果Table 2 Modeling results of different spectral preprocessing methods

2.4 建模变量的选择

CARS算法采用蒙特卡罗采样方法，即从校正集随机抽取一部分样本建立PLS模型，反复进行上百次取样，对变量逐个筛选，最终选取关键的波长变量，同时CARS 通过引入EDF 解决了变量选择中的组合爆炸问题［31］。CARS 和PLS 相结合可以简化建模过程，提高预测模型的精度。在本研究中，CARS算法运行100 次，每次运行均使用80%的随机样本建立PLS 模型。图2A～C 分别显示了CARS 程序运行过程中DPPH 模型采样变量数、交叉验证均方根误差（RMSECV）的变化趋势以及各变量的回归系数路径。从图2A可以看出，在基于EDF的变量提取的第一阶段，随着采样次数的增加，保留变量的数量迅速减少，第二阶段则缓慢减少，属于典型的EDF 两步筛选。从图2B 中可以看出，采样运行次数在0～58范围内，由于剔除了大量不相关变量，RMSECV 缓慢下降；在58次采样运行后，RMSECV 基本保持稳定，直到去除一些有用信息变量后，RMSECV 才显著增加。如图2C 所示，当采样次数为58 次时，RMSECV 达到最小值，在图2C 中用蓝色垂直星号线标记，第58 次采样时保留的变量数为34。通过CARS，DPPH、ABTS和FRAP分别选择34、66和50个变量进行建模。

图2 DPPH光谱数据的CARS变量选择图Fig．2 Plots of CARS variables selection on spectra data for DPPH A，B and C show the changing trend of the number of sampled wavelengths，RMSECV values and the regression coefficient path of each wavelength with the increase of sampling runs，respectively

2.5 潜在变量数量的选择

采用PLS法建立定量校正模型时，潜在变量（LVs）数量的选择是否合适对于所建定量模型的预测性能影响较大，LVs数量太多会出现过拟合现象；LVs数量太少，则会导致建模信息不全，模型预测性能下降［32］。本研究采用“留一法”交互验证选择LVs数量，“留一法”交互验证是对某一个LVs数量，从n个校正样本中选取1个样本进行预测，用n-1个样本建立校正模型，预测留取的这一个样本，经反复建模及预测，直至这n个样本均被预测1 次且只被预测1 次，则得到对应这一LVs 数量的RMSECV，选择最小RMSECV对应的LVs数量为最佳LVs数量。由图3可知，当CARS-PLS模型的LVs数为7时（如图3 中星号所示），RMSECV 最小。表3 中给出了DPPH、ABTS 和FRAP 的CARS-PLS 模型的最佳LVs 数量，分别为7、9和10。

表3 Full-PLS和CARS-PLS模型结果Table 3 Results of the Full-PLS and CARS-PLS models

图3 DPPH的CARS-PLS模型在不同LVs数量下的RMSECV值Fig．3 RMSECV values at different numbers of LVs for DPPH CARS-PLS model

3 讨 论

表3 给出了DPPH、ABTS 和FRAP 的Full-PLS 和CARS-PLS 建模结果，粗体表示最佳模型建模结果。可以看出，3 个抗氧化活性指标的CARS-PLS 模型均明显优于Full-PLS 模型。RMSEP 分别由2．63%、0．89%和3．63μmol/L 下降至2．42%、0．73%和3．60 μmol/L。因此分别建立了DPPH、ABTS 和FRAP 的CARS-PLS 定量校正模型，校正模型参考值与预测值的相关性见图4。图4 中样本的参考值与预测值均匀分布在回归线两侧，3 个抗氧化活性指标CARS-PLS 模型的RC和RP均大于0．96，预测性能较高。

图4 CARS-PLS模型参考值与预测值的相关性图Fig．4 Correlation diagrams of reference values and predicted values for the CARS-PLS models

图5 为预测集参考值与预测值的对比图。图中3 个抗氧化活性模型的近红外预测值与参考值均十分接近，变化趋势基本保持一致，表明预测集样本各指标抗氧化活性的预测值与参考值之间呈现良好的相关性，3个模型均可准确预测羊栖菜的抗氧化活性。

图5 预测集参考值与预测值的对比图Fig．5 Comparison diagrams of reference values and predicted values of prediction sets

4 结 论

本研究采用NIRS 结合CARS 算法建立了一种快速测定羊栖菜抗氧化活性的方法。基于近红外光谱和抗氧化活性指标建立PLS 定量模型，采用异常光谱识别方法、光谱预处理方法和建模变量选择方法优化模型性能。结果显示，所构建的3种抗氧化活性指标的CARS-PLS模型均可达到定量分析要求，RP均在0．96以上，证实了NIRS和CARS算法在羊栖菜抗氧化活性快速测定中的可行性。所构建的方法快速、便捷、环保，有助于提升羊栖菜的质量控制水平，推动我国羊栖菜走向国际市场。