罗 瑶，胡本祥, 2，张 晗，史嘉周，姬海月, 2，净易尧，陈晓颖，王帮庆，颜永刚，赵 璠，李艳茸，彭 亮*

卵叶远志叶绿体基因组序列特征与系统发育分析

罗 瑶1，胡本祥1, 2，张 晗1，史嘉周1，姬海月1, 2，净易尧1，陈晓颖1，王帮庆3，颜永刚1，赵 璠4，李艳茸4，彭 亮1*

1. 陕西中医药大学 药学院/陕西省秦岭中草药应用开发工程技术研究中心/“秦药”研发重点实验室，陕西 咸阳 712046 2. 陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712046 3. 汉中市科技资源统筹中心，陕西 汉中 723000 4. 榆林市第五医院，陕西 榆林 719000

解析卵叶远志叶绿体因组的序列特征和系统发育关系。利用CTAB法提取卵叶远志叶片基因组DNA，通过Illumina HiSeq平台测序，再用GetCellelle组装叶绿体基因组，通过MEGA11构建邻接法（neighbor-joining，NJ法）系统发育树。卵叶远志的叶绿体基因组全长165 192 bp，GC含量为36.70%，共编码124个基因，其中包含8个rRNA基因、42个tRNA基因和74个蛋白编码基因；相对同义密码子使用度显示，67.29%的密码子的使用度＞1，密码子偏好A、T结尾；共检测到287个简单重复序列（simple sequence repeats，SSR），其中以单核苷酸重复次数最多，占80.61%，单核苷酸主要由A和T组成，这表明在碱基形成过程中A和T被频繁使用；边界分析显示，9种远志属植物叶绿体基因组边界较为稳定，卵叶远志、香港远志、远志、瓜子金和合叶草基因结构存在相似性；变异分析显示，9种远志属植物叶绿体基因组变异幅度较小；系统发育分析结果显示，卵叶远志、香港远志、瓜子金、远志、合叶草和西南远志因较高的支持率可聚成一支。构建了高质量的卵叶远志全叶绿体基因组，为卵叶远志的遗传结构和遗传多样性研究奠定了基础。

远志；卵叶远志；叶绿体基因组；序列特征；系统发育

远志为远志科远志属多年生草本植物远志Willd.或卵叶远志L.的干燥根[1]。远志是我国42种重点保护的三级野生品种和85种传统出口大宗药材之一，也是目前临床益智药处方中使用度名列前3位的单味中草药，被视为养命之要药[2]。远志药用历史悠久，始载于《神农本草经》，目前已从远志药材中分离和鉴定出140多种化合物，包括皂苷类、𠮿酮类、寡糖酯类、生物碱类等[3]。其中，远志皂苷类、𠮿酮类以及寡糖酯类作为远志药材中最主要的药效成分，具有广泛的药理活性，如抗衰老、神经保护、抗抑郁、催眠镇静、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗心律失常等[4]。

叶绿体（chloroplast，cp）是古代细菌内共生体的后代，系植物细胞中的重要细胞器，负责光合作用和新陈代谢等，为植物生存和生长提供必要的能量[5]。高等植物的叶绿体基因组中存在典型的环式双链结构，其大小在120～180 kb，由4部分构成，包含1个小单拷贝区（small single copy，SSC）、1个大单拷贝区（large single copy，LSC）和2个反向重复区（inverted repeats，IRs）[6-7]。叶绿体基因组DNA（cpDNA）独立于核基因组，表现出半自主的遗传特征，可作为物种鉴定、系统发育、起源进化等研究的依据[8-9]。研究发现，基于叶绿体基因组的分子条形码具有极佳的物种鉴定潜力[10-11]，且完整的叶绿体基因组序列可以为植物物种和种群水平上的准确鉴定提供可靠的条形码[12-13]。同时，通过比较叶绿体基因组序列为发现序列变异和识别突变热点区域提供了机会，还可以检测出基因缺失和重复事件。因此，从叶绿体基因组序列获得的突变热点区域和简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）可以作为物种鉴定和群体遗传学的有效分子标记[14]。随着二代测序技术（next generation sequencing，NGS）的普及和发展，叶绿体基因组数据库日益丰富。在解析植物类群系统发育关系研究中逐渐得到广泛应用，迄今已有1000多种植物完成了叶绿体基因组的测序，在植物系统发育地位、物种鉴定、进化分析等解析方面发挥重要作用[15]。

目前，远志研究多集中于远志及其药材，而有关卵叶远志L.的研究，仅有少数是关于资源调查、化学成分和药理作用等方面[16-17]，尚缺乏其叶绿体基因组及遗传背景信息的系统研究与分析。据此，本研究采用高通量测序技术以获得卵叶远志叶绿体全基因组序列信息，并利用生物信息学相关软件，分析其序列特征、基因组成及系统发育关系，以期为该药用植物的遗传结构和遗传多样性研究奠定研究和理论基础，也为将来远志属植物的亲缘关系解析及新药源寻找等提供支撑。

1 材料

卵叶远志采自陕西省太白县大贯子（N 107.2883205°，E 33.99384660°，海拔1302 m），经陕西中医药大学胡本祥教授鉴定为远志科卵叶远志L.，取卵叶远志的新鲜叶片，液氮速冻后存于−80 ℃冰箱，用于DNA提取。植物凭证样本保存于陕西中医药大学标本馆（PS20211001）。

2 方法

2.1 基因组DNA提取和测序

取卵叶远志的新鲜幼嫩叶片，通过改良十六烷基三甲基溴化铵法（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）[18]提取基因组DNA，经电泳检测和浓度测定后，置−20 ℃冰箱留存备用。超声处理基因组DNA，通过末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成文库构建，再通过Illumina高通量测序平台Illumina HiSeq测序，以此来获得序列原始数据。

2.2 叶绿体基因组组装与注释

Illumina数据使用Trimmomatic v0.36[19]以去除接头和低质量数据。参数设置如下：前导：20；尾随：20；滑动窗口：4∶15；最小镜头：36；平均合格：20。处理完后的高质量clean data，使用GetCellelle对叶绿体基因组进行组装，拼接软件对优化序列进行多个Kmer参数的拼接，长度设置为107、117和127 bp。使用在线网站CHLOROBOX（https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html）对组装好的叶绿体基因组进行注释[20]。使用OGDRAW绘制叶绿体全基因组图谱[21]。最终注释的叶绿体基因组上传于GenBank中，注册号为OP870084。

2.3 叶绿体基因组序列比较分析

为消除氨基酸组成对密码子使用的影响，采用MEGA11[22]分析同义密码子使用量、相对同义密码子使用值（relative synonymous codon usage，RSCU）、碱基组成和密码子含量的变化特征。使用SSRHunter软件（http://www.biosoft.net）鉴定叶绿体基因组中的SSR[23-24]。参数设置为单核苷酸至六核苷酸8、5、4、4、4、4。SC/IR边界使用IRSCOPE[25]进行作图分析。同样，通过mVISTA[26]（https://genome.lbl.gov/vista/mvista/ submit.shtml）做全基因组对比，分析时勾选全局对比（Shuffle-LAGAN），对远志属9种叶绿体基因组序列做同源性对比分析。

2.4 系统发育分析

从NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上下载远志科远志属植物远志（NC_050829）、香港远志（NC_066219.1）、瓜子金（NC_052912.1）、密花远志（NC_056971.1）、西南远志（NC_ 060367.1）、合叶草（OP_612815.1）、黄花倒水莲（NC_052911.1）、荷包山桂花（NC0_56971.1），选取楝科香椿属植物香椿（NC_059806.1）和楝科非洲楝属植物非洲楝（NC_037362.1）作为外类群，共11个物种完整的叶绿体基因组序列通过在线软件MAFFT version7 （https://mafft.cbrc.jp/ alignment/ server/）进行多序列对比[27]，利用MEGA11构建邻接法（neighbor-joining，NJ）系统发育树[28]，自展次数为1000[28]。

3 结果与分析

3.1 叶绿体基因组的结构

卵叶远志叶绿体基因组具有典型的四分体结构（图1），由LSC区域（165、192～248、865），SSC区域（120、409～128、457），IRA（128、458～165、191）和IRB（83、674～120、408）组成。叶绿体基因组全长165 192 bp，GC含量约为36.7%（表1）。

图1 卵叶远志叶绿体基因组图谱

表1 卵叶远志叶绿体基因组碱基组成

Table 1 Base composition of chloroplast genome in P. sibirica

区域A/%T/%C/%G/%GC/%碱基长度/bp IRA29.231.120.918.839.8 36 734 IRB31.129.218.820.939.8 36 735 SSC38.432.115.314.329.6 8049 LSC32.032.218.016.834.8 83 674 总量31.531.818.718.036.7165 192

3.2 基因组成

基因注释结果显示，卵叶远志叶绿体基因组共注释得到124个基因，包括8个核糖体RNA（rRNA）基因、42个转运RNA（tRNA）基因和74个蛋白编码基因（coding sequence，CDS）（表2）。注释的基因中存在1个内含子的为、、、、、等，存在2个内含子的基因为和。

表2 卵叶远志叶绿体基因组上的基因

Table 2 Genes located on chloroplast genome of P. sibirica

基因类别基因名称数量 tRNAtrnA-UGC*(2)、trnC-GCA、trnD-GUC、trnA-UGC*(2)、trnC、GCA、trnD-GUC、trnE-UUC、trnF-GAA、trnG-GCC、trnH-GUG、trnI*(2)、trnK-UUU*、trnL-CAA(2)、trnL-UAA*、trnL-UAG、trnM-CAU(4)、trnN-GUU(2)、trnP-UGG、trnQ-UUG(3)、trnR-ACG(2)、trnR-UCU、trnS-CGA*、trnS-GCU、trnS-GGA、trnS-UGA、trnT-GGU、trnT-UGU、trnV-GAC(2)、trnW-CCA、trnY-GUA42 rRNArrn4.5(2)、rrn5S(2)、rrn16S(2)、rrn23S(2)8 核糖体蛋白小亚基rps3、rps4、rps7(2)、rps8、rps11、rps12**(2)、rps14、rps15(2)、rps18、rps1913 核糖体蛋白大亚基rpl2*(2)、rpl14、rpl16*、rpl20、rpl23(2)、rpl368 RNA聚合酶rpoA、rpoB、rpoC1*、rpoC24 NADH脱氢酶亚基ndhA*(2)、ndhB*(2)、ndhC、ndhD、ndhE、ndhF、ndhG、ndhH(2)、ndhI(2)、ndhJ、ndhK15 光系统I亚基psaA、psaB、psaC、psaJ4 光系统II亚基psbA、psbB、psbC、psbD、psbE、psbF、psbH、psbJ、psbK、psbM、psbN、psbT、psbZ13 色素细胞b/f复合物亚基petA、petB*、petG、petL4 ATP合成酶亚基atpA、atpB、atpE、atpF*、atpH、atpI6 Rubisco大亚基rbcL1 成熟酶matK1 被膜蛋白cemA1 乙酰CoA羧化酶accD*1 色素细胞C合成酶ccsA1 未知功能蛋白ycf3**、ycf42 合计 124

*-内含子为1**-内含子为2

*-one intron**-two introns

3.3 密码子偏好分析

卵叶远志叶绿体密码子研究发现，64个蛋白编码基因共编码35 541个密码子。亮氨酸（Leu）使用频率最高，异亮氨酸（Ile）次之，半胱氨酸（Cys）使用度最低，分别为3775（10.62%）、3075（8.65%）、423（1.19%）。密码子使用偏好显示，卵叶远志叶绿体基因组中RSCU＞1的密码子占总量的67.29%，表现出以A、T结尾的特征（表3）。

3.4 SSR分析

卵叶远志叶绿体基因组中鉴定出单、二、三、四、五、六核苷酸SSRs位点共287个，其数量分别为240、28、4、8、3、4。其中，单核苷酸重复次数最多，占比80.61%（表4）。

表3 卵叶远志密码子信息

Table 3 Codon usage in P. sibirica

密码子氨基酸数量RSCU密码子氨基酸数量RSCU GCAAla 5931.12CCCPRO 3240.88 GCCAla 3060.58CCGPRO 2410.66 GCGAla 2490.47CCUPRO 5091.39 GCUAla 9611.82CAAGln 9111.48 UGCCys 1220.58CAGGln 3220.52 UGUCys 3011.42AGAArg 5881.65 GACAsp 2350.38AGGArg 2640.74 GAUAsp 9871.62CGAArg 4791.34 GAAGlu12911.48CGCArg 1600.45 GAGGlu 4500.52CGGArg 1390.39 UUCPhe 6910.66CGUArg 5141.44 UUUPhe14051.34AGCSer 2080.49 GGAGly 9951.51AGUSer 5031.19 GGCGly 2920.44UCASer 4581.08 GGGGly 4720.72UCCSer 4030.95 GGUGly 8711.32UCGSer 2390.56 CACHis 2380.56UCUSer 7301.72 CAUHis 6131.44ACAThr 5021.13 AUAIle 9530.93ACCThr 3410.77 AUCIle 5780.56ACGThr 2090.47 AUUIle15441.51ACUThr 7231.63 AAALys12911.50GUAVal 7071.40 AAGLys 4260.50GUCVal 2450.49 CUALeu 4290.68GUGVal 2810.56 CUCLeu 2680.43GUUVal 7821.55 CUGLeu 2100.33UGGTrp 6551.00 CUULeu 7721.23UACTyr 2830.42 UUALeu13042.07UAUTyr10641.58 UUGLeu 7921.26UAAStop 1691.19 AUGMet 8011.00UAGStop 1240.87 AACAsn 3350.45UGAStop 1340.94 AAUAsn11611.55CCAPro 3941.07

表4 卵叶远志叶绿体基因组的SSRs

Table 4 Distribution of SSRs within P. sibirica chloroplast genome

核苷酸类型重复序列数量占比/% 单核苷酸A/TC/G230 1080.13 3.48 二核苷酸AG/CTAT/AT 5 23 1.74 8.01 三核苷酸AAG/CTTAAT/ATT 1 3 0.34 1.04 四核苷酸AAAG/CTTTAAAT/ATTTATCC/ATGG 1 5 2 0.34 1.74 0.69 五核苷酸AAAAT/ATTTTAATCT/AGATT 2 1 0.69 0.34 六核苷酸AAAGAT/ATCTTTAAGATC/ATCTTGAAGATG/ATCTTC 1 1 2 0.34 0.34 0.69

3.5 边界分析

选取NCBI上已发布的8种远志属植物叶绿体基因组SC/IR进行边界分析，显示远志属植物叶绿体基因组存在4个边界。如图2所示，LSC/IRb区域中，除密花远志L.及西南远志L.外，其余7种均位于rps19基因编码区。其中，向LSC区域扩张1 bp的香港远志L.、远志、瓜子金和合叶草；扩张2bp的为西伯利亚远志；扩张7bp的为黄花倒水莲和荷包山桂花。IRb/SSC区有4种在基因编码区，5种在基因非编码区，其中香港远志和荷包山桂花分别向IRb扩张10bp和3bp。SSC/IRa区，所有物种都在基因和基因之间的非编码区，且均向SSC区扩张，该区域无剧烈变化。在IRa/LSC，除西南远志处于基因编码区外，其他8种均在基因和基因之间的非编码区，均向IRa区有不同程度的扩张。边界分析表明，远志属植物叶绿体基因组在其IR边界具有一定差异，总体而言基因边界变异幅度较小，叶绿体基因组较为保守。显示出西伯利亚远志、香港远志、远志、瓜子金和合叶草在SC/IR边界的结构上存在相似性。

图2 9种远志属植物叶绿体基因组的IR/SC边界变化情况

3.6 远志属植物叶绿体基因组变异分析

以卵叶远志（GenBank注册号为NC056970）为注释，对9种远志属植物进行叶绿体基因组全序列对比分析（图3）。结果表明，9种远志属植物叶绿体基因组的4个基因区间组成较为一致，差异性较小。从4大区段来看，LSC区差异性最大，变异程度最高，而IRA区则差异性最小，最为保守。从非基因编码区和基因编码区来看，非基因编码区变异程度较高，基因编码区较为保守，但在、、、和等基因编码区变异程度较大，存在显著差异。

图3 远志属植物叶绿体基因组全局比对分析

3.7 系统发育分析

利用邻接法构建系统发育树（图4），结果显示11个物种可分为远志科和外类群的楝科。远志科的9种远志属植物以100%支持率构成一个分支，与楝科区分开。同时，远志属中香港远志、卵叶远志、瓜子金、远志、合叶草和西南远志可聚成一支，而密花远志、荷包山桂花和黄花倒水莲则聚为姐妹支。

图4 基于叶绿体全基因组序列构建NJ系统进化树

4 讨论

卵叶远志作为远志中药材的2种基原植物之一，具有重要的药用价值和经济价值。卵叶远志和远志分布和产地也基本相同，远志药材的质量标准中并未区分卵叶远志与远志的种间区别，也未客观确定各自的质量指标，有关药用远志的研究也主要集中在远志方面。近年来，对卵叶远志的研究也在逐渐加深[29]，但目前尚缺乏关于其遗传信息的研究。基于此，本研究完成了卵叶远志叶绿体基因组的测序、组装和注释工作，并分析了其结构、GC含量、基因组成、密码子使用度、SSR等，着重对9种远志属植物进行了叶绿体基因组边界分析、变异分析及系统发育分析等。研究发现，卵叶远志叶绿体基因组为经典的环状四分结构，全长为165 192 bp，其GC含量为36.75%，共编码124个基因，其中含有一个内含子的基因有14个，含有2个内含子的基因有2个。同时，和大多数被子植物叶绿体基因组一样[30]，卵叶远志中也存在未知功能基因，如和基因，仍有待进行突破性研究。

密码子是生物体中连接氨基酸、蛋白质和遗传物质的重要核心元素，在生物个体遗传信息的传递中起重要作用[31]。大多数氨基酸不仅由一种密码子编码，也可以同时由2～3种密码子编码，生物体对于不同的密码子的使用具有一定偏好性[32]。密码子偏好的研究使用为蛋白质表达及其相应功能的研究提供了可靠的信息。密码子偏好也可作为微调基因表达的手段[33]，双子叶植物密码子偏好以A/T结尾，单子叶子叶植物偏好则与双子叶植物不同，偏向G/C[34]。对卵叶远志密码子分析可知，卵叶远志密码子RSCU＞1的有67.29%，偏好为以A、T结尾。

目前，SSR是主要存在于基因外部和基因非编码区的共显性标记，也称微卫星，可用于群体遗传学研究的分子标记[35]。在卵叶远志叶绿体基因组中，检测出的SSRs位点共有287个，其中单核苷酸重复次数最多，占80.61%。单核苷酸主要由A和T组成，这也表明卵叶远志叶绿体基因组在碱基形成过程中A和T被频繁使用。

远志属植物叶绿体基因组的SC/IR边界，虽存在部分扩张或收缩情况，但大体来说，整个基因组仍然较为保守，卵叶远志、远志、瓜子金、香港远志和合叶草基因结构存在相似性。在对其进行全序列比对时，LSC区和非基因编码区变异程度较高，IRa区和大部分基因组编码区保守程度较高。本研究通过全序列对比，结合边界分析与系统发育结果，得出卵叶远志与香港远志聚为一支，且与远志、瓜子金具有较高的亲缘关系。与王星璐等[36]构建的进化树存在一些差异，分析其系统发育关系可知，瓜子金和卵叶远志聚为一支，二者又与香港远志聚类到一起，瓜子金、卵叶远志、香港远志和远志为姊妹类群，表明四者亲缘关系最近关系密切，推测差异原因可能与样本的采集环境及变异有关。

本研究通过文库构建、高通量测序、组装和序列分析，系统解析了卵叶远志叶绿体基因组，分析了其叶绿体基因组序列特征和系统发育关系，有助于深入开展后续分子标记、DNA条形码技术等研究,为进一步探究该药用植物卵叶远志的遗传结构和遗传多样性奠定了基础。同时，也增添了卵叶远志在分子生药学方面的部分研究，为加快对卵叶远志的研究以及在基因层面鉴别该种属提供了相关依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Chloroplast genome sequence characteristics and phylogenetic analysis of

LUO Yao1, HU Ben-xiang1, 2, ZHANG Han1, SHI Jia-zhou1, JI Hai-yue1, 2, JING Yi-yao1, CHEN Xiao-ying1, WANG Bang-qing3, YAN Yong-gang1, ZHAO Fan4, LI Yan-rong4, PENG Liang1

1. College of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine/Shaanxi Engineering Research Center for Application and Development of Chinese Medicine in Qinling Mountains/Key Laboratory of “Qin Medicine” Research and Development, Xianyang 712046, China 2. Shaanxi Institute of International Trade & Commerce, Xianyang 712046, China 3. Hanzhong Science and Technology Coordination Center, Hanzhong 723000, China 4. Yulin No.5 Hospital, Yulin 719000, China

To identify the sequence characteristics and phylogenetic relationships ofchloroplast genome.The genomic DNA of leaves was extracted by CTAB method and sequenced by the Illumina HiSeq platform, and the chloroplast genome was assembled by GetCellelle, and the neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree was constructed by MEGA11.The total length of the chloroplast genome ofwas 165 192 bp, with a GC value of 36.70%. The chloroplast genome ofhas 124 coding genes, with the numbers of CDS, tRNA, and rRNA were 74, 42, and 8, respectively; relative synonymous codon usage showed that 67.29% of codons had a usage level large than 1, and codons preferred A and T endings. A total of 287 simple sequence repeats (SSRs) were detected, and the number of single nucleotide repetitions was the highest, accounting for 80.61 %. Mononucleotides are mainly composed of A and T, indicating that A and T are frequently used during base formation. Boundary analysis showed that the chloroplast genome boundaries of nine species ofwere relatively stable, and the gene structures of,,,andwere similar. Variation analysis showed that the chloroplast genome variation of nine species ofwas small. The results of phylogenetic analysis showed that,,,,andcould be clustered into one branch due to their high support rates.The high-quality whole chloroplast genome ofwas constructed, which laid a foundation for the study of genetic structure and genetic diversity of.

Willd.;L.; chloroplast genome; sequence characterization; phylogenetic analysis

R286.12

A

0253 - 2670(2023)18 - 6065 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.024

2023-03-03

国家自然科学基金资助项目（82003899）；陕西省科技厅社发攻关一般项目（2021SF-364）；公益性行业（中医药）科研专项经费项目（201507002-1-08）；陕西中医药大学校级课题项目（2020GP28）；陕西中医药大学“秦药”品质评价及资源开发学科创新团队项目（2019-QN01）

罗 瑶（1997—），女，在读硕士研究生，从事中药资源质量评价与分子生药学研究。E-mail: 2207256840@qq.com

彭 亮（1985—），男，副教授，从事中药资源评价与开发利用、分子生药学研究。E-mail: ppengliang@126.com

[责任编辑 时圣明]