赵子慧，胡思婧，陈高策，叶欣园，刘 燕，张泉龙，徐金龙，秦路平，韩 婷，张巧艳,

• 药理与临床 •

基于大麻素2型受体和雌激素受体α研究升麻和黑升麻含药血清对成骨细胞功能的影响

赵子慧1，胡思婧1，陈高策1，叶欣园1，刘 燕1，张泉龙1，徐金龙2，秦路平1，韩 婷3*，张巧艳1, 3*

1. 浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053 2. 中国人民解放军联勤保障部队第九六九医院，内蒙古 呼和浩特 010051 3. 中国人民解放军海军军医大学药学院，上海 200433

研究升麻和黑升麻含药血清基于大麻素2型受体（cannabinoid receptor type 2，CB2R）与雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）对成骨细胞骨形成的调控作用。采用高分辨质谱法鉴定升麻和黑升麻中的化学成分；升麻与黑升麻含药血清或与CB2R反向激动剂AM630或ERα抑制剂ICI联合处理MC3T3-E1成骨细胞，CCK-8法测定细胞增殖活性；试剂盒测定碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性；茜素红染色观察成骨细胞骨矿化结节的形成；Western blotting检测骨形成相关蛋白及CB2R与ERα的表达。升麻和黑升麻中分别鉴定了12、14个化学成分，其中有3个共有成分。升麻和黑升麻含药血清可显著增加成骨细胞的增殖、ALP活性和骨矿化结节形成，增加CB2R和ERα及骨形成相关蛋白的表达。15%升麻含药血清对MC3T3-E1成骨细胞增殖、ALP活性、骨矿化结节形成及骨形成相关蛋白表达的促进作用可被AM630和ICI所逆转，15%黑升麻含药血清对MC3T3-E1细胞骨形成的促进作用仅可被ICI所逆转。升麻含药血清可通过CB2R与ERα双靶点促进成骨细胞的骨形成，黑升麻含药血清仅通过激活ERα增加成骨细胞的骨形成。

升麻；黑升麻；成骨细胞；大麻素2型受体；雌激素受体α；升麻消旋体A；7,8-二羟基升麻醇；2′--acetyl cimicifugoside H-1

骨质疏松症是危害老年人健康的重大疾病，其发生与骨形成的成骨细胞功能减退和骨吸收的破骨细胞活性增强有关[1-2]。成骨细胞和破骨细胞的形成分化和功能受多个靶点和信号通路的调控。大麻素2型受体（cannabinoid receptor type 2，CB2R）和雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）为调控成骨细胞和破骨细胞功能的关键靶点。CB2R主要存在于骨骼及外周免疫系统，其激动剂HU308可激活成骨细胞的CB2R，缓解雌激素缺乏导致的骨质疏松症[3]。CB2R激动剂因其无精神成瘾样的不良反应[4]，已成为调控骨代谢药物研究的新热点。ERα在成骨细胞和破骨细胞中高度表达，ERα激动剂对骨骼具有保护作用，如抗骨质疏松药物雷诺昔芬、他莫昔芬等。研究证明，以ERα为靶点的雷诺昔芬、他莫昔芬对CB2R也有一定的激动作用[5]。成骨细胞中CB2R和ERα的激活均可以调节Wnt/β-catenin通路，并增强成骨相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）的表达，促进骨形成[6-7]。因此，同时激活CB2R和ERα靶点的药物，可显著增强成骨细胞的骨形成，有效防治骨质疏松症。

升麻为毛茛科植物大三叶升麻Kom.、兴安升麻(Turcz.) Maxim.或升麻L.的干燥根茎，具有抗肿瘤、抗骨质疏松症、神经保护等多种生物活性[8-9]。在欧洲和北美，来源于同属植物黑升麻L.的制剂常用于缓解更年期综合征及骨质疏松症的治疗[10-11]。研究表明升麻与黑升麻的抗骨质疏松症及缓解更年期症状的作用效果相似[12]，表明升麻也可作为替代和补充治疗剂，用于骨质疏松症、更年期综合征等疾病的防治。然而，升麻和黑升麻在细胞水平上对骨代谢的调控作用及机制尚不清楚。因此，本研究基于CB2R和ERα双靶点，比较升麻与黑升麻含药血清对成骨细胞功能的调控作用，为将升麻开发为抗骨质疏松症的临床补充药物提供科学依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级SD大鼠60只，体质量200～250 g，购自浙江中医药大学实验动物中心，许可证号SCXK（浙）2021-0361，动物饲养于浙江中医药大学实验动物研究中心，室温（25±2）℃，相对湿度45%～50%，自由进食饮水。本研究中所有实验动物的使用严格遵守浙江中医药大学伦理规定（批准号20221207Aazz0619080878）。

1.2 细胞

小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1（目录号GNM15）来自中国科学院（上海）细胞库。

1.3 药材

升麻（批号210901）购自浙江中医药大学中药饮片有限公司，经浙江中医药大学药学院秦路平教授鉴定为毛茛科植物升麻L.的干燥根茎。

1.4 药品与试剂

黑升麻制剂胶囊（批号LG15353.A01）购自澳洲Nature’s Way公司；甲酸（批号A800013）、甲醇（批号M921074）购自上海麦克林生化科技有限公司；乙腈（批号45983，色谱纯）购自默克有限公司；α-MEM培养基（批号TBD41061）购自天津灏洋生物制品科技有限公司；4%多聚甲醛（批号R20497）购自上海源叶生物科技有限公司；磷酸酶蛋白酶抑制剂（批号P1045）、Western及IP裂解液（批号P0013J）、上样缓冲液（批号P0015）、脱脂奶粉（批号P0216）、Western一抗稀释液（批号P0023A）、牛血清白蛋白（批号ST023）、BCA蛋白定量试剂盒（批号P0010）、30%丙烯酰胺溶液（批号ST003）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8，批号ST788）、1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8，批号ST768）、过硫酸铵（批号ST005）、TEMED（批号ST728）、DAPI染色液（批号061819191015）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒（批号121820210416）购自上海碧云天生物技术有限公司；Tris（批号A501492-0500）、甘氨酸（批号A502065-0500）购自上海生工生物科技有限公司；胎牛血清（批号10091-148）、CB2R反向激动剂AM630（批号GC10147）、ERα抑制剂ICI（批号A1428）购自APExBIO公司；青霉素-链霉素（批号15140-122）购自美国GLPBIO公司；ECL显色液（批号1925901）购自美国Millipore公司；CCK-8增殖检测试剂盒（批号ab228554）、成骨细胞特异基因Osterix兔多克隆抗体（批号ab22552）、I型胶原蛋白（type I collagen，COL-1）兔单克隆抗体（批号ab138492）、兔抗单克隆CB2抗体（批号ab259323）、兔抗单克隆BMP2抗体（批号ab14933）、兔抗单克隆ER抗体（批号ab32063）购自英国Abcam公司；Runx2兔多克隆抗体（批号12556S）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多克隆抗体（批号AF7021）购自美国Affinity公司。

1.5 仪器

Vanquish超高液相色谱仪、Q Exactive PLUS Mass Spectrometer质谱仪、ST16R型低温高速离心机、371型CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；LC-10N-50A型冷冻干燥机（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；XP105型电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器公司）；PowerPac Basic双垂直电泳仪、Synergy H1型多功能酶标仪（美国伯腾公司）；Eclipse Ti-s型荧光相差倒置显微镜（日本Nikon公司）；RE-2000A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

2 方法

2.1 样品制备

升麻饮片100 g，用60%乙醇以1∶10的固液比回流提取2次，每次2 h，滤过浓缩后冻干，最终产率为19.8%。依据《中国药典》2020年版一部中升麻成人最高剂量为10 g，按照体表面积换算得大鼠ig剂量为180 mg/kg；黑升麻胶囊推荐用量为每日0.667 g，换算得大鼠ig剂量为60 mg/kg。

2.2 升麻和黑升麻化学成分的UPLC-Q-TOF-MS分析

2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取升麻提取物和黑升麻胶囊内容物各40 mg，加入80%甲醇溶液500 μL，45 Hz、240 s加钢珠匀浆，冰水浴超声处理1 h，−20 ℃静置1 h。4 ℃、12 000 r/min离心15 min后，取上清液过0.22 μm微孔滤膜于进样瓶中备用。

2.2.2 高效液相色谱条件 Waters XSelect®HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～15 min，5%～95% B；15.0～15.1 min，95%～5% B；15.1～20.0 min，5% B。体积流量为0.4 mL/min；柱温30 ℃；进样量1 μL。

2.2.3 质谱条件 鞘气体积流量30 L/h；辅助气体积流量10 L/h；离子透镜电压55.0 V；喷雾电压3.8、−3.2 kV；毛细管温度320 ℃；辅助气加热器温度300 ℃；ESI离子源；雾化气压379.22 kPa；辅助气压379.22 kPa；气帘气压241.32 kPa；温度550 ℃；喷雾电压5500 V（正离子模式）；轰击能量40 eV；碰撞能差20 eV。利用控制软件（Analyst TF 1.7，AB Sciex）基于信息依赖型扫描功能（information dependent acquisition，IDA）在每个数据采集循环中，筛选出强度最强且大于100的分子离子采集二级质谱数据。使用Progenesis QI软件导入原始数据，进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分和峰对齐等，利用自建二级质谱数据库及相应裂解规律匹配法进行鉴定。

2.3 升麻及黑升麻含药血清的制备

60只大鼠称定体质量（）后分为3个区组，第1区组18只（200 g≤＜210 g），第2区组18只（210 g≤＜230 g），第3区组24只（230 g≤≤250 g），依次对大鼠进行编号，按照完全随机法分为3个给药组，每组20只，分别ig生理盐水、180 mg/kg升麻提取物、60 mg/kg黑升麻胶囊内容物，1次/d；各组连续给药7 d后，腹主动脉取血，4 ℃静置2 h，3000 r/min离心15 min，分离上清液，为消除个体化差异将3个给药组血清分别合并后，56 ℃灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜滤过除菌后分装，冻存于−80 ℃保存备用。

2.4 细胞培养

将状态良好的MC3T3-E1细胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的α-MEM培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞生长至70%～80%时传代，用于后续实验。）

2.5 成骨细胞的处理及指标测定

2.5.1 药物处理 MC3T3-E1细胞培养24 h，用5%、10%、15%的升麻或黑升麻含药血清处理后，进行指标测定。为了观察CB2R和ERα抑制剂对升麻含药血清对成骨细胞作用的逆转作用，在细胞给药前30 min，加入1 μmol/L CB2R反向激动剂AM630，或者1 μmol/L ERα抑制剂ICI，培养，进行指标测定。

2.5.2 成骨细胞增殖和ALP活性检测 将MC3T3-E1细胞以1×104/孔接种于96孔板，细胞贴壁后，分别加入升麻或黑升麻含药血清，继续培养24、48、72 h，加入10 μL CCK-8溶液培养30 min后，测定450 nm处的吸光度（）值。

MC3T3-E1细胞以5×103/孔接种于96孔板中，按“2.5.1”项下方法处理，加入成骨诱导液（5×10−3mol/Lβ-甘油磷酸、100 mg/L抗坏血酸和1×10−8mol/L地塞米松）诱导成骨分化。给药7 d，按照试剂盒说明书测定ALP活性。将培养的细胞用预冷的PBS冲洗2次，加入ALP染色液，37 ℃染色30 min后，PBS洗涤细胞3次，显微镜下观察拍照。

2.5.3 骨矿化结节诱导及茜素红ARS染色 将MC3T3-E1细胞以1×104/孔接种96孔板中，按“2.5.1”项下方法处理，成骨诱导14 d后，用预冷的PBS冲洗细胞2次，每孔加入50 μL 4%多聚甲醛中固定30 min，用含40 mmol/L茜素红的ARS（pH 4.2）染色30 min，光学显微镜下观察成骨细胞骨矿化结节的形态和数目。用10%氯化十六烷吡啶磷酸钠溶解骨结节，并在570 nm处测定值。

2.5.4 Western blotting分析 将MC3T3-E1细胞以2×105/孔接种于6孔板中，按“2.5.1”项下方法处理，成骨诱导7 d后，用预冷的PBS冲洗细胞3次，每孔加入200 μL RIPA裂解液，冰上裂解30 min，离心，取上清，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度后变性。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，用5%胎牛血清蛋白封闭后，分别加入成骨相关蛋白抗体（1∶1000）、GAPDH抗体（1∶1000）、CB2R抗体（1∶500）、ERα抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶3000），37 ℃孵育1 h，用MONAD QuickChemi 5100化学发光成像系统显影并定量分析条带。

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 基于UPLC/Q-TOF/MS的升麻和黑升麻化学成分的比较

收集整理国内外升麻属植物化学成分研究的相关文献，建立包括化合物英文名称、分子式、结构式、精确相对分子质量及特征碎片的化学成分文献信息数据库，比较化学成分的质谱信息，对检测到的化合物进行鉴定。如图1所示，在正离子模式下采集数据，通过对保留时间、精确相对分子质量及二级质谱碎片等的对比分析，从升麻提取物中共鉴定12个化学成分，包括升麻酸C、norkhelloside、升麻消旋体A、cimiheracleins A、cimigenol-3--β--galactopyranoside、7,8-二羟基升麻醇、25-methoxy-24--acetylisohurinol、2′--acetyl cimicifugoside H-1、25--methylcimigenol-3--α--ara、cimiracemoside C、金龟草二醇和升麻醇-3-酮；从黑升麻胶囊内容物中共鉴定14个化学成分，包括去甲猪毛菜碱、cimicifugolide C、升麻酸A、15,16--14-carboxyl-16-oxo-hydro-shengmanol-3--β--xyl、3--α--ara-24--acetylhydroshengmanol-15--β--glucose、3,4-二甲氧基肉桂酸、升麻消旋体A、阿克特素、15,16--升麻新醇C、7,8-二羟基升麻醇、cimiracemoside J、2′--acetyl cimicifugoside H-1、cimicinol和24--acetylhydroshengmanol，其中升麻和黑升麻提取物中均检测到的成分为升麻消旋体A、7,8-二羟基升麻醇及2′--acetyl cimicifugoside H-1。

1-升麻酸C 2-norkhelloside 3-升麻消旋体A 4-cimiheracleins A 5-cimigenol-3-O-β-D-galactopyranoside 6-7,8-二羟基升麻醇 7-25-methoxy-24-O-acetylisohurinol 8-2′-O-acetyl cimicifugoside H-1 9-25-O-methylcimigenol-3-O-α-L-ara 10-cimiracemoside C 11-金龟草二醇 12-升麻醇-3-酮 13-去甲猪毛菜碱 14-cimicifugolide C 15-升麻酸A 16-15,16-seco-14-carboxyl-16-oxo-hydro-shengmanol-3-O-β-D-xyl 17-3-O-α-L-ara-24-O-acetylhydroshengmanol-15-O-β-D-glucose 18-3,4-二甲氧基肉桂酸 19-阿克特素 20-15,16-seco-升麻新醇C 21-cimiracemoside J 22-cimicinol 23-24-O-acetylhydroshengmanol

3.2 升麻与黑升麻含药血清基于CB2R及ERα对MC3T3-E1细胞增殖的影响

如表1所示，5%、10%和15%的升麻和黑升麻含药血清作用24 h，对MC3T3-E1细胞的增殖均无显著影响。5%和10%的升麻和黑升麻含药血清作用24 h，对MC3T3-E1细胞的增殖均无显著影响。升麻和黑升麻含药血清分别作用48 h均可剂量相关性地显著促进MC3T3-E1细胞的增殖（＜0.05、0.01、0.001）。CB2R反向激动剂AM630或ERα抑制剂ICI预处理后能逆转15%升麻或黑升麻含药血清对成骨细胞增殖的促进作用（＜0.01、0.001）；AM630和ICI共同处理后更加有效逆转升麻或黑升麻含药血清对成骨细胞增殖的促进作用（＜0.001），表明升麻或黑升麻含药血清可能通过激活CB2R和ERα增加成骨细胞的增殖。

3.3 升麻与黑升麻含药血清基于CB2R及ERα对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响

成骨细胞表达ALP，参与其分化和骨基质的矿化。ALP活性常用于表征成骨细胞的分化和骨基质矿化功能。如图2所示，5%、10%和15%的升麻与黑升麻含药血清均可显著增加成骨细胞ALP活性，且呈剂量相关性（＜0.01、0.001）。AM630、ICI及二者共同预处理均可逆转15%升麻含药血清对成骨细胞ALP活性的促进作用（＜0.001），且AM630和ICI共同处理的逆转作用更为显著（＜0.01、0.001），表明升麻通过激活CB2R及ERα增加成骨细胞ALP的活性。AM630预处理不能逆转15%黑升麻含药血清对成骨细胞ALP的促进作用，而ICI预处理能够逆转15%黑升麻含药血清对ALP活性的促进作用，表明黑升麻可能仅通过激活ERα增加成骨细胞ALP的活性。

表1 升麻与黑升麻含药血清对MC3T3-E1细胞增殖的影响及AM630和ICI的逆转作用(, n = 3)

与含相同浓度血清的对照组比较：*＜0.05**＜0.01***＜0.001；与无AM630或ICI的15%药物处理组比较：◆＜0.05◆◆＜0.01◆◆◆＜0.001

*< 0.05**< 0.01***< 0.001control group containing the same concentration of serum;◆< 0.05◆◆< 0.01◆◆◆< 0.00115% drug treatment group without AM630 or ICI

与对照组比较：*＜0.05**＜0.01***＜0.001；与无AM630或ICI的15%药物处理组比较：◆＜0.05◆◆＜0.01◆◆◆＜0.001；与AM630及ICI联合给药组比较：#＜0.05##＜0.01###＜0.001，图3、5、6同

*< 0.05**< 0.01***< 0.001control group;◆< 0.05◆◆< 0.01◆◆◆< 0.00115% corresponding drug treatment group without AM630 or ICI;#< 0.05##< 0.01###< 0.001AM630 and ICI combined administration group, same as figs. 3, 5 ,6

3.4 升麻与黑升麻含药血清基于CB2R及ERα对MC3T3-E1细胞骨矿化结节形成的影响

成骨细胞通过矿化产生骨基质，增加骨量。如图3所示，5%、10%和15%的升麻与黑升麻含药血清均可显著促进成骨细胞矿化结节的形成（＜0.01、0.001）。AM630和ICI预处理均可逆转15%升麻含药血清对成骨细胞矿化结节形成的促进作用（＜0.001），且AM630和ICI共同处理后，逆转作用更加显著（＜0.01、0.001），表明升麻含药血清通过激活CB2R及ERα增加成骨细胞的矿化。ICI预处理可逆转15%黑升麻含药血清对骨矿化结节的促进作用（＜0.05），但AM630预处理对不能逆转15%黑升麻含药血清对骨矿化结节的促进作用，表明黑升麻仅通过激活ERα增加成骨细胞的矿化。

图3 升麻与黑升麻含药血清对MC3T3-E1细胞骨矿化结节形成的影响及AM630和ICI的逆转作用(, n = 3)

3.5 升麻与黑升麻含药血清对MC3T3-E1细胞CB2R与ER-α及骨形成相关蛋白表达的影响

BMP2、Runx2和Osterix是参与成骨细胞功能调控的关键蛋白，COL-1是成骨细胞分泌的基质蛋白，这些蛋白表达水平的高低，反映了成骨细胞的骨形成能力。如图4所示，5%、10%和15%的升麻与黑升麻含药血清均可显著上调成骨细胞BMP2、Runx2、Osterix及COL-1的表达（＜0.05、0.01、0.001），且呈剂量相关性，表明升麻和黑升麻含药血清可促进成骨细胞的形成和分化。

如图5所示，15%的升麻含药血清可显著上调成骨细胞CB2R与ERα，及骨形成相关蛋白BMP2、Runx2、Osterix及COL-1的表达（＜0.001），AM630、ICI或两者共同预处理可逆转15%升麻含药血清对成骨细胞CB2R、ERα及骨形成蛋白BMP2、Runx2、Osterix及COL-1表达的促进作用（＜0.05、0.01、0.001），进一步表明升麻含药血清通过激活CB2R与ERα促进成骨细胞的形成、分化和骨矿化作用。

如图6所示，15%的黑升麻含药血清可显著上调成骨细胞CB2R与ERα，及骨形成相关蛋白BMP2、Runx2、Osterix及COL-1的表达，其对成骨细胞关键蛋白表达的增强作用可被ICI逆转，而不能被AM630逆转。

与对照5%组比较：◆P＜0.05 ◆◆◆P＜0.001；与对照10%组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；与对照15%组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001

图5 升麻含药血清对成骨细胞CB2R与ERα及骨形成相关蛋白表达影响及AM630和ICI的逆转作用(, n = 3)

图6 黑升麻含药血清对成骨细胞CB2R与ERα及骨形成相关蛋白表达影响及AM630和ICI的逆转作用(, n = 3)

4 讨论

目前，骨质疏松症的治疗药物如雌激素、双磷酸盐、甲状旁腺素等均存在一定程度的不良反应。中药和天然药物均有不良反应小、可长期服用等特点，在骨质疏松症的防治上具有明显的优势[13-14]。动物实验研究表明升麻和黑升麻提取物可显著减少去卵巢骨质疏松大鼠的骨丢失[15-16]。黑升麻在欧美长期用于防治更年期综合征和骨质疏松症。本研究发现升麻与黑升麻含药血清可显著增加成骨细胞的增殖活性、ALP活性、骨矿化结节形成及成骨细胞BMP2和Runx2等关键蛋白的表达，显示出确切的促进成骨细胞骨形成的作用。升麻含药血清对成骨细胞功能的促进作用可被CB2R反向激动剂AM630或ERα抑制剂ICI所逆转，表明升麻含药血清可能通过激活CB2R与ERα双靶点发挥调控骨代谢的作用。黑升麻含药血清对成骨细胞功能的促进作用仅可被ERα抑制剂ICI逆转，CB2R反向激动剂AM630对黑升麻含药血清促进成骨细胞功能的作用没有显著影响，表明黑升麻仅通过激活ERα促进成骨细胞的骨形成。这些结果可为升麻和黑升麻临床用于防治骨质疏松症提供科学的依据。

成骨细胞的分化和骨形成在维持骨重塑平衡和骨量方面起着关键作用。成骨细胞是参与骨形成的关键效应细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化，并完成骨重建。BMP在未分化间充质细胞向成骨细胞的分化中起关键作用，Runx2和Osterix是成骨细胞分化和骨形成所需的转录因子[17]。MC3T3-E1细胞系是小鼠成骨前体细胞系，该细胞系在体外经诱导可分化为成骨模型，常用于研究药物对成骨细胞增殖和分化影响的研究。本实验观察升麻和黑升麻含药血清对MC3T3-E1的增殖、分化、矿化及关键蛋白表达的影响，发现升麻和黑升麻含药血清能显著促进成骨细胞的增殖、ALP的活性、骨矿化结节的形成及骨形成关键蛋白的表达，具有抗骨质疏松症的作用。在成骨细胞增殖研究中，发现含药血清干预成骨细胞24、48、72 h中，仅在48 h有显著的增殖作用，在24、72 h增殖效果不显著，可能是因为药物干预24 h后，药效作用于成骨细胞时间较短，未有显著增殖；药物干预72 h后增殖效果不显著，可能是因为成骨细胞在给药48 h后达到一定程度增殖，所以对照组与给药处理未显示出差别。

CB2R可在成骨细胞上表达，激活成骨细胞CB2R的表达，可增加成骨细胞的骨形成作用[18]。成骨细胞CB2R的表达增加，可激活BMP/Wnt/β-catenin通路，增加Runx2和BMP2的表达，进而促进成骨细胞的增殖、ALP活性和骨基质矿化。本研究发现升麻与黑升麻含药血清作用于成骨细胞后，可促进成骨细胞增殖、ALP活性和骨矿化结节形成及Osterix、BMP2、Runx2及COL-1的表达，CB2R反向激动剂AM630可以逆转升麻含药血清对成骨细胞的作用，而不能逆转黑升麻含药血清的作用，表明升麻含药血清通过激活CB2R促进骨形成相关蛋白的表达调控成骨细胞功能，而黑升麻则可能不是通过直接激活CB2R发挥促进成骨细胞骨形成作用的。

ERα为成骨细胞上调控骨代谢的关键靶点，雌激素通过ERα在维持骨骼稳态和防治绝经后骨质疏松症中发挥着重要作用。临床上治疗骨质疏松症的药物如戊酸雌二醇、他莫昔芬和雷诺昔芬等选择性雌激素受体调节剂均以ERα为靶点发挥调控骨代谢作用[19]。本研究发现升麻与黑升麻含药血清对成骨细胞功能的促进作用可被雌激素受体拮抗剂ICI所逆转，显示升麻和黑升麻可通过ERα调控成骨细胞的功能。然而，对ERα具有激动活性的药物常可引起乳腺癌、子宫内膜癌及心血管疾病等不良反应[20-22]，因此，后期需要进一步评价升麻和黑升麻用于骨质疏松症防治可能产生的相关不良反应。

升麻和欧美常用的天然药物黑升麻均来源于毛茛科升麻属植物，均具有三萜及苷类、酚酸类、色酮类、生物碱、含氮类等化合物[23]。本研究鉴定了升麻提取物中三萜及苷类8个、酚酸类1个、色酮类2个；天然药物黑升麻中三萜及苷类8个、酚酸类3个、生物碱类1个。其中共有成分3种，分别为酚酸类成分升麻消旋体A、三萜及苷类成分7,8-二羟基升麻醇和2′--acetyl cimicifugoside H-1。升麻中三萜及其苷类主要为升麻苷H-1，其质量分数为0.53%～1.09%[24]；酚酸类以咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸为主，质量分数分别为0.57%～1.75%、0.22%～1.79%、12.18%[25]；色酮类以升麻素为主，质量分数为0.73%～5.81%[24]。天然药物黑升麻胶囊内容物的主要成分为三萜及其苷类成分，其质量分数为2.5%。本研究发现升麻可能通过激活CB2R与ERα发挥促进成骨细胞增殖、分化和骨基质矿化的作用，表明升麻含有CB2R和ERα激动剂类化学成分；但黑升麻可能仅通过激活ERα发挥促进成骨细胞增殖、分化和骨基质矿化的作用。因此，后续有必要深入挖掘升麻和黑升麻对CB2R和ERα有激动作用的化学成分，明确其结构特征，为进一步的升麻和黑升麻调控骨代谢的机制阐明及新型抗骨质疏松症先导化合物的发现奠定基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Effects ofand black cohosh medicated serum on osteoblasts functions based on CB2R and ERα

ZHAO Zi-hui1, HU Si-jing1, CHEN Gao-ce1, YE Xin-yuan1, LIU Yan1, ZHANG Quan-long1, XU Jin-long2, QIN Lu-ping1, HAN Ting3, ZHANG Qiao-yan1, 3

1. School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China 2. 969 Hospital of PLA Joint Logistics Support Forces, Hohhot 010051, China 3. School of Pharmacy, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

To study the regulatory effects ofand black cohosh medicated serum on osteoblastic bone formation based on cannabinoid receptor type 2 (CB2R) and estrogen receptor α (ERα).High-resolution mass spectrum was used to identify the chemical constituents inand black cohosh. The osteoblastic MC3T3-E1 cells were treated with various concentrationsand black cohosh medicated serum or the combination with CB2R inverse agonist AM630 or ERα antagonist ICI. CCK-8 method was used to determine the proliferation of MC3T3-E1 cells. The assay kit was used to measure the alkaline phosphatase (ALP) activity. The alizarin red staining was used to detect the formation of bone mineralized nodules in MC3T3-E1 cells. Western blotting was applied to analyze the expressions of CB2R, ERα and related proteins with osteoblastic bone formation.A total of 12 chemical constituents were identified in, and 14 constituents in black cohosh, with three common constituents. Bothand black cohosh medicated serum significantly increased the proliferation, ALP activity and the formation of bone mineralized nodules, and also enhanced the expression of CB2R, ERα and related proteins associated with osteoblastic bone formation. Moreover, the promoting effects 15%medicated serum on osteoblastic MC3T3-E1 cells could be reversed by AM630 and ICI, while the improvement effects of 15% black cohosh medicated serum on osteoblast only could be reversed by ICI.medicated serum increased the osteoblastic bone formation via activation of CB2R and ERα and black cohosh medicated serum enhanced the osteoblastic bone formation only via activiation of ERα.

L.; black cohosh; osteoblast; cannabinoid receptor type 2; estrogen receptor α; cimicifugate racemimer A; 7,8-dihydroxy cohoshol; 2′--acetyl cimicifugoside H-1

R285.5

A

0253 - 2670(2023)18 - 5941 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.012

2023-05-05

上海市科委科技支撑计划项目（22S21901600）；国家自然科学基金资助项目（81973534）

赵子慧，女，硕士研究生，研究方向为中药活性成分及其作用。E-mail: zzh18684297873@163.com

韩 婷，教授，主要从事中药活性成分及资源开发利用研究。E-mail: hanting@smmu.edu.cn

张巧艳，教授，主要从事中药活性成分及其作用机制研究。E-mail: zqy1965@163.com

[责任编辑 李亚楠]