张晨晨，张东旭，张玉凤，张爱杰，董世奇，韩 峰，邢界红，樊慧蓉，刘昌孝

基于“化学物质组-血中移行成分-药动学”的蒙药暖宫七味丸质量标志物研究

张晨晨1, 2，张东旭1, 2，张玉凤1, 2，张爱杰2，董世奇2，韩 峰3，邢界红4，樊慧蓉2*，刘昌孝5

1. 天津中医药大学，天津 301617 2. 中国医学科学院放射医学研究所，天津 300192 3. 内蒙古自治区药品检验研究院，内蒙古 呼和浩特 010020 4. 内蒙古蒙药股份有限公司，内蒙古 通辽 028000 5. 天津药物研究院，天津 300462

研究蒙药暖宫七味丸的化学物质组、血中移行成分及药动学，筛选出暖宫七味丸潜在的质量标志物。综合运用UPLC-Triple-TOF-MS/MS、GC-MS技术结合数据库及对照品对比，鉴别暖宫七味丸的化学物质组、血中移行成分；使用UPLC-Q-TRAP-MS/MS研究其体内药动学特征。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴别出暖宫七味丸中的76个化学成分，采用GC-MS鉴别出35个化合物。经大鼠ig给药后鉴别出19个吸收进入血中的原型成分，其中，沉香四醇、绿原酸、科罗索酸表现出良好的可测性，且具有明显的药动学特征。沉香四醇、绿原酸、科罗索酸在暖宫七味丸的化学物质组-血中移行成分-药动学研究中具有良好的可测性和可追溯性，可作为暖宫七味丸潜在的质量标志物。

暖宫七味丸；质量标志物；化学物质组；血中移行成分；药动学；沉香四醇；绿原酸；科罗索酸

暖宫七味丸（苏格木勒-7）出自蒙医学经典著作《观者之喜》，由天门冬、手掌参、沉香、豆蔻、肉豆蔻、黄精和丁香组成，是治疗妇科疾病的蒙医传统方剂[1]。其中，豆蔻、肉豆蔻、丁香和沉香均具有抑赫依作用；手掌参生精壮阳、主治肾寒；黄精强肾固阳；天门冬固精、镇赫依[2]。全方中7味药配伍合理，调赫依、具有温暖子宫和驱寒止痛的功效[3]。临床上常用于治疗气滞腰痛、小腹冷痛等疾病[2]。暖宫七味丸作为临床治疗痛经的复方药，现有研究多集中在药效学和临床方面的宏观治疗作用评价，其药效物质基础尚未明确，很大程度上限制了产品质量标准的提高及深入开发。

中药质量标志物（quality marker，Q-Marker）是刘昌孝院士[4]及其团队提出的作为反映中药安全性和有效性的标示性物质进行质量控制的新概念。在其有效、特有、传递与溯源、可测和处方配伍的“五原则”基础上，张铁军等[5]提出了复方中药Q-Marker研究路径和方法。蒙药和中药一样大多为天然药物，同样有复杂的化学成分，甚至很多蒙药和中药的来源也相同。目前蒙药的质量标准体系并不完善，中药质量标准的研究经验对蒙药质量标准化有着宝贵的借鉴意义。本研究利用LC-MS/MS、GC-MS技术对暖宫七味丸的化学物质组、血中移行成分及其药动学进行研究，结合Q-Marker“五原则”探寻蒙药暖宫七味丸潜在的质量标志物，以期为其药效物质基础研究和质量控制标准的提升提供依据和思路。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪（Exion AD UPLC）、Triple TOF 4600质谱仪、QTRAP 5500质谱仪均购自美国AB SCIEX公司；KQ5200DE型超声波清洗器（上海右一仪器有限公司）；LAB DANCER S000型涡旋振荡器（美国IKA公司）；Legend Micro 17R高速冷冻离心机（美国Thermo scientific公司）；7890A/5975C气质联用仪（美国Aglient公司）；FD-2型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）。

1.2 试剂与药品

暖宫七味丸药粉（内蒙古蒙药集团）；色谱纯甲醇（美国Fisher Scientific公司）；色谱纯乙腈（美国Sigma公司）；色谱纯甲酸（天津大茂化学试剂有限公司）；纯化水（屈臣氏公司）；对照品去氢木香烃内酯（中国食品药品检定研究院，批号L8AT-ABV5，质量分数≥98%）、绿原酸（甄准生物科技有限公司，批号ZZS-20-114-A8，质量分数≥98%）、科罗索酸（甄准生物科技有限公司，批号ZZS19110708，质量分数≥98%）、木香烃内酯对照品（中国食品药品检定研究院，批号TJTD-CTHA，质量分数≥98%）、沉香四醇（甄准生物科技有限公司，批号ZZS-20-112-A4，质量分数≥98%）、丁香酚（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号D-064-161216，质量分数≥98%）、槲皮素（中国食品药品检定研究院，批号110759-201105，质量分数≥98%）；异榄香脂素（甄准生物科技有限公司，批号ZZS-20-114-A2，质量分数≥98%）；去氢二异丁香酚（中国食品药品检定研究院，批号L8AT-ABV5，质量分数≥98%）；氯仿（天津大茂化学试剂有限公司）；石油醚（天津大茂化学试剂有限公司）；醋酸乙酯（天津大茂化学试剂有限公司）；羧甲基纤维素钠（德国默克公司）。

1.3 动物

SPF级雌性SD大鼠，体质量（200～220）g，6～7周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号 SCXK（京）2021-0011。经检疫后安置在中国医学科学院放射医学研究所SPF动物室，饲养于温度（25±2）℃、相对湿度50%～60%、12 h/12 h昼夜交替光照的环境中，自由进食饮水。所有动物实验均遵循中国医学科学院放射医学研究所动物伦理委员会的规定，动物实验伦理号：IRM-DWLL-2021128。

2 方法

2.1 暖宫七味丸化学物质组的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

2.1.1 液相条件 色谱柱为Diamonsil C18（2），200 mm×4.6 mm，5 μm；柱温40 ℃；流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～2 min，65% B；2～5 min，65%～25% B；5～45 min，25%～5% B；45～50 min，5% B；50～51 min，5%～65% B；51～60 min，65% B；体积流量为0.4 mL/min；进样体积7.5 μL。

2.1.2 质谱条件 采用Triple TOF进行分析，电喷雾离子源温度：500 ℃；质谱电压：5500 V；去簇电压DP：60 V；碰撞电压EP：10 V；离子源气体I和气体II均为397.21 kPa；气帘气：241.32 kPa；采用多反应检测模式；设置全扫描范围为/50～1000。

2.1.3 供试品药液的制备 取暖宫七味丸药粉，称取1.00 g置入烧杯，加入20 mL 75%甲醇水溶液，超声1 h，静置至室温，以溶剂补足减失质量，再以0.22 μm有机滤膜进行滤过，得到质量浓度为50 mg/mL暖宫七味丸提取液，再以50%甲醇溶液将其提取液稀释10倍，稀释后质量浓度为5 mg/mL，吸取适量稀释后提取液进行LC-MS分析。

2.1.4 对照品溶液的制备 取对照品去氢木香烃内酯、科罗索酸、槲皮素、木香烃内酯、去氢二异丁香酚和沉香四醇粉末，各精密称取适量加甲醇溶液制成1.0 mg/mL的储备液。精密吸取液体对照品100 μL丁香酚、100 μL异榄香脂素置入不同的量瓶中，加入甲醇溶液稀释定容。分别取适量各稀释后的对照品溶液，以0.22 μm有机滤膜滤过，滤液即为混合对照品溶液，待进样分析。

2.1.5 数据处理与分析 前期整理大量文献，收集汇总暖宫七味丸中药材所含成分的质谱信息。取“2.1.3”项下暖宫七味丸供试品溶液进UPLC-Triple-TOF-MS/MS测定，采集所有样品的二级质谱图，将采集到的暖宫七味丸二级质谱图输入Peakview2.2软件中与中药化合物数据库中的信息进行比对，结合前期收集到的质谱信息和对照品比对确定化合物的结构。

2.2 暖宫七味丸化学物质组的GC-MS分析

2.2.1 检测方法

（1）色谱条件：色谱柱为HP-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm）；气化室温度250 ℃；传输线温度300 ℃；色谱柱温度设置为程序升温：起始温度为50 ℃（保持3 min），以5 ℃/min升温至120 ℃（保持1 min），再以10 ℃/min升温至300 ℃（保持10 min）；载气He；载气体积流量为1.0 mL/min；进样量为1 μL。

（2）质谱条件：EI源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；扫描模式为Scan；扫描质量范围为/30～500，溶剂延迟3 min。

2.2.2 提取液的制备 称取暖宫七味丸粉末2.00 g，加入氯仿20 mL，密闭浸泡30 min后称定质量，超声40 min，待恢复至室温后用氯仿补足减失质量，得到100 mg/mL暖宫七味丸提取母液，将暖宫七味丸提取母液稀释至5 mg/mL，滤过后进GC-MS检测。

2.2.3 定性定量方法

（1）定性分析：对检测出的成分采用MS数据库NIST11和保留时间进行定性分析。数据库筛选结果中要扣除掉柱流失峰等，最终将相似度≥90的化合物确认为暖宫七味丸挥发性成分。

（2）定量分析：面积归一化法对挥发油中各种化学组分的相对百分含量进行定量分析，即以鉴定成分峰面积占所有鉴定成分面积之和的百分比作为定量结果。

2.3 暖宫七味丸血中移行成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

2.3.1 色谱方法 液相条件与质谱条件同“2.1.1”和“2.1.2”项。

2.3.2 ig药液的制备 精密称取30.00 g暖宫七味丸粉末，使用300 mL纯甲醇超声处理60 min得到药液。将药液抽滤后取滤液旋蒸浓缩，将旋蒸浓缩液用40 ℃氮气进一步浓缩，将浓缩物加入到10 mL 0.5% CMC-Na搅拌均匀得到含药量为3 g/mL的浸膏，涡旋并存放于4 ℃冰箱，备用（给药量为10 mL/kg，相当于30 g/kg）。

2.3.3 分组、给药及样本采集 取SD雌性大鼠4只，给药前12 h禁食不禁水。取空白血后以10 μL/g的容积ig给药。在给药后0.5、1、2、4、6、8、12、24 h进行目内眦取全血500 μL左右于抗凝处理过的离心管内，离心取上清，冷冻保存备用。

2.3.4 生物样本处理方法 取“2.3.3”项中的冻存血浆，置于冰水中待其恢复为液体状态，取250 μL血浆置于2 mL EP管中，加入1000 μL 70%乙腈甲醇溶液，离心，取上清液，氮吹，待浓缩至干燥后，加入125 μL复溶液，振摇混匀，离心，取上清进行测定。

2.4 暖宫七味丸在大鼠体内的药动学研究

2.4.1 正离子模式检测方法

（1）液相条件：色谱柱为Agilent C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱温40℃；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～0.5 min，40% B；0.5～3.0 min，40%～90% B；3.0～4.5 min，90% B；4.5～4.6 min，90%～40% B；4.6～6.5 min，40% B）；体积流量为0.2 mL/min；进样体积2.0 μL。

（2）质谱条件：采用QTRAP 5500 质谱进行分析，电喷雾离子源温度：550℃；质谱电压：5000 V；去簇电压DP：80 V；碰撞电压EP：10 V；离子源气体I和气体II均为413.69 kPa；气帘气：241.32 kPa；在正离子、MRM模式下检测，用于定量的离子对为沉香四醇/319.3→300.9，维拉帕米（内标物）/455.2→165.1。

2.4.2 负离子模式检测方法

（1）液相条件：色谱柱为Agilent C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱温40℃；流动相A为10 mmol/L乙酸铵-水，流动相B为乙腈，梯度洗脱（0～3 min，40% B；3～4 min，40%～95% B；4～6.5 min，95% B；6.5～6.6 min，95%～40% B；6.6～8.0 min，40% B）；体积流量为0.2 mL/min；进样体积2.0 μL。

（2）质谱条件：采用Triple TOF进行分析，电喷雾离子源温度：550℃；质谱电压：4500 V；去簇电压DP：−170 V；碰撞电压EP：−10 V；离子源气体I和气体II分别为310.26、379.21 kPa；气帘气：241.32 kPa；在负离子、MRM模式下检测，用于定量的离子对为科罗索酸/471.3、绿原酸/353.1→191.0、甘草次酸（内标物）/469.3→355.1。

2.4.3 供试品药液的制备 称取54 g暖宫七味丸粉末，使用540 mL甲醇超声处理60 min得到药液。将药液抽滤过滤，取滤液旋蒸浓缩，将旋蒸浓缩液冻干得到冻干粉，在冻干粉中加入18 mL 0.5% CMC-NA搅拌均匀得到含药量为3 g/mL的浸膏（30 mg/kg），涡旋并存放于4℃冰箱，备用。

2.4.4 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品沉香四醇、科罗索酸、绿原酸和内标维拉帕米、甘草次酸粉末适量，加甲醇溶液制成1 mg/mL的储备液。精密吸取各对照品溶液适量，加50%甲醇溶液稀释制成混合对照品溶液备用。沉香四醇质量浓度为0.5、1、10、50、100、300、500 ng/mL，科罗索酸和绿原酸质量浓度为1、5、10、30、60、100 ng/mL，内标维拉帕米、甘草次酸质量浓度为100 ng/mL。

2.4.5 生物样本采集 雌性SD大鼠6只，以1 mL/100 g的容积ig给药。实验前12 h禁食不禁水，在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h进行眼眶取血300 μL左右于抗凝处理过的离心管内，离心取上清，冷冻保存备用。

2.4.6 生物样本处理方法 取“2.4.5”项下的冻存血浆，置于冰水中待其恢复为液体状态，取50 μL血浆置于2 mL EP管中，加入50 μL内标溶液和100 μL 70%乙腈甲醇溶液，离心，取上清液，置于内插管中，再次离心后进行测定。

3 结果

3.1 暖宫七味丸化学物质组分析

采用HPLC-Triple-TOF-MS技术对暖宫七味丸中主要化学成分进行表征，通过Peakview 2.2软件数据库匹配，再结合标准品和相关文献确定结构式，从暖宫七味丸中鉴别出暖宫七味丸提取液，其结果见表1，暖宫七味丸药液的基峰色谱图见图1。共鉴别出76个化合物。

3.1.1 氨基酸类化合物 本实验共从暖宫七味丸中鉴别出氨基酸12种，主要来自于黄精和天冬，该类分子易失去小分子碎片，如-COOH、-NH3。在正离子模式下，以瓜氨酸举例进行裂解规律分析（图2-A和图3-A），在MS2镜像图中瓜氨酸的碎片离子峰有/159.076 7 [M＋H－NH3]+和/113.070 5 [M＋H－NH3－COOH]+即为瓜氨酸分子脱去-NH3和脱去-COOH及-NH3的碎片离子。依据文献报道[6]以及数据库比对可以判定该化合物为瓜氨酸。

3.1.2 挥发油类化合物 本实验共从暖宫七味丸中鉴别出挥发油类20个，主要来自于沉香、丁香、白豆蔻和肉豆蔻。在正离子模式下（＋ESI），以沉香四醇举例进行裂解规律分析（图2-B、3-B），该化合物准分子离子峰/319.110 0 [M＋H]+，在MS2镜像图中，其主要碎片离子峰有/301.105 8 [M＋H－H2O]+和/283.095 7 [M＋H－H2O－H2O]+。经与对照品比对以及数据库匹配，初步鉴定该化合物为沉香四醇。

3.1.3 萜类化合物 本实验共从暖宫七味丸中鉴别出萜类化合物10种，主要来自于丁香，该类化合物易发生开环裂解，如果环内存在双键则易发生RDA裂解。在正离子模式下，以去氢木香烃内酯举例进行裂解规律分析，该化合物准分子离子峰为/231.138 2 [M＋H]+，在MS2镜像图图中，其特征碎片离子峰有/213.127 1 [M＋H－H2O]+、/185.131 9 [M＋H－H2O－CO]+、/157.100 6 [M＋H－C3H6O2]+、/142.078 0 [M＋H－C4H9O2]+、/128.061 2 [M＋H－C5H11O2]+、/195.116 3 [M＋H－H4O2]+、/143.085 3 [M＋H－C4H8O4]+、/180.092 6 [M＋H－C4H3]+、/175.075 0 [M＋H－C4H8]+、/165.069 7 [M＋H－C5H6]+。经与对照品比对和数据库匹配，可以鉴定该化合物为去氢木香烃内酯。

表1 UPLC-Q-TOF-MS法分析暖宫七味丸化学成分及入血成分

Table 1 UPLC-Q-TOF-MS identification results of chemical constituents absorbed into blood of Nuangong Qiwei Pills

编号tR/min理论值(m/z)实测值(m/z)分子式离子模式误差(×10−6)MS/MS碎片离子鉴定成分来源 14.38176.103 5176.102 9C6H13N3O3[M＋H]+−0.59159.076 7, 113.070 5瓜氨酸[6]T 24.86182.081 7182.081 2C9H11NO3[M＋H]+0.09147.043 1, 136.075 8, 119.048 5酪氨酸[7]T 34.44106.050 4106.049 4C3H7NO3[M＋H]+−4.7660.043 3L-丝氨酸[6]T 44.48120.066 1120.065 3C4H9NO3[M＋H]+−1.8856.047 6D-苏氨酸[6]T 54.65116.071 2116.070 4C5H9NO2[M＋H]+−1.12116.072 6, 70.064 3脯氨酸[8]T 66.72166.086 8166.086 3C9H11NO2[M＋H]+−0.09120.080 6, 118.065 1苯丙氨酸[7]T 74.96132.102 5132.101 8C6H13NO2[M＋H]+−0.8186.096 5, 69.069 3 异亮氨酸[8]T 83.69147.113 3147.112 7C6H14N2O2[M＋H]+−0.4084.080 0, 68.980 7, 56.048 7赖氨酸[8]T 94.49148.061 0148.060 4C5H9NO4[M＋H]+−0.3784.044 3, 56.049 2谷氨酸[8]T 103.71175.118 9175.119 0C6H14N4O2[M＋H]+0.3070.063 9, 60.054 8精氨酸[7]T 117.40205.097 7205.097 0C11H12N2O2[M＋H]+−0.74159.092 4, 146.057 1色氨酸[8]T 124.59134.045 2134.044 2C4H7NO4[M＋H]+−4.57118.085 7, 88.040 4, 74.023 3天冬氨酸[6]T 1311.23287.113 1287.126 8C13H18O7[M＋H]+4.97212.077 3天麻素S 1418.77251.107 2251.106 6C17H14O2[M＋H]+−0.08160.051 0, 91.053 82-(2-苯乙基)色酮*[9]C 15a36.62473.347 9473.362 4C30H48O4[M＋H]+−0.24437.339 9, 409.344 6, 249.185 0, 203.179 6, 189.163 9科罗索酸*[10]DX 1613.15237.185 5237.184 8C15H24O2[M＋H]+−0.37189.124 6, 135.117 5, 117.067 5, 107.086 7莪术醇S 13.11235.186 5235.185 5C15H24O2[M－H]−−0.47117.067 5, 107.086 7 17a19.93233.153 6233.153 5C15H20O2[M＋H]+−0.02145.101 0, 131.084 9, 119.083 5土木香内酯*[11]DX 19.88231.153 9231.154 6C15H22O2[M－H]−−0.11128.064 1, 119.082 1, 105.071 2 18a9.97319.118 2319.117 3C17H18O6[M＋H]+−0.94301.105 8, 283.095 7沉香四醇*[12]C 1920.85281.117 2281.117 3C18H16O3[M＋H]+0.45190.062 5, 175.039 0, 151.039 2, 124.052 16-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮*[9]C 2016.75311.128 3311.127 7C19H18O4[M＋H]+−0.18220.072 1, 205.049 1, 181.049 5, 177.055 0, 154.062 86-甲氧基-2-(3-甲氧基-2-苯乙基)色酮*[9]C 2113.21313.107 6313.106 8C18H16O5[M＋H]+−0.80273.143 9, 233.152 7, 187.148 0, 163.074 1, 147.116 9, 121.064 36,8-二羟基-2-(2(3'-甲氧基-4'-羟基苯乙基))色酮*[9]C 22a10.24303.108 0303.108 0C15H10O7[M＋H]+5.10229.060 8, 153.019 0, 137.024 1槲皮素[13]D 2327.46595.166 3595.164 7C27H30O15[M＋H]+−1.81271.060 3木蝴蝶苷BS 2411.22287.128 3287.127 5C15H10O6[M＋H]+−0.83269.116 6木犀草素[14]D 2512.31249.148 5249.148 4C15H20O3[M＋H]+−0.34183.077 9, 178.078 4, 165.068 6, 155.084 4, 141.069 0, 128.062 6, 115.053 8, 105.069 5丁香内酯D 2613.52195.101 6195.101 7C10H10O4[M＋H]+0.87177.054 0, 89.035 8异阿魏酸[15]DX 274.68361.165 1361.152 7C20H24O6[M＋H]+−3.40327.119 4, 311.086 4, 221.079 6, 153.017 6落叶松脂素[15]N 2822.86359.149 5359.149 5C20H22O6[M＋H]+−3.27359.231 6, 343, 3 060, 326.280 0, 227.176 0, 210.148 5松脂酚N 29a23.95327.159 6327.159 1C20H22O4[M＋H]+0.07286.119 4, 271.095 5, 257.081 5, 239.070 1去氢二异丁香酚[16]R, D 3016.10209.117 8209.117 2C12H16O3[M＋H]+0.03153.054 2, 138.029 2, 110.035 2榄香脂素[15]R, D 3114.42345.169 7345.169 9C20H24O5[M＋H]+0.70203.107 5, 188.080 2, 171.083 7, 151.074 9, 137.059 6, 133.065 9, 122.034 9fragransinA2*[17]R 3216.33357.180 8357.169 3C21H24O5[M＋H]+−0.90193.084 6, 165.090 1, 161.057 8, 150.066 2,fragnasol C[17]R

续表1

续表1

编号tR/min理论值(m/z)实测值(m/z)分子式离子模式误差(×10−6)MS/MS碎片离子鉴定来源 654.94193.071 2193.070 5C7H12O6[M＋H]+−0.60111.042 0, 83.048 9, 69.032 3奎宁酸[7]DX 6613.85376.188 5376.183 9C21H27O6[M＋H]+−4.52357.166 3, 314.118 5, 222.122 2, 203.089 3, 181.087 3, 167.069 9, 151.075 9, 137.058 8肉豆蔻异木脂素[18]R, D 67a14.14165.091 5165.090 9C10H12O2[M＋H]+−0.27137.063 1, 105, 692丁香酚*[26]DX 6830.27279.232 5279.231 2C18H30O2[M－H]−−3.34173.136 8, 95.085 8, 67.053 5亚油酸[13]DX 6936.62495.345 6495.344 7C30H48O4[M＋Na]+0.42451.356 5常春藤皂苷元C 7021.32231.138 5231.137 9C15H18O2[M＋H]+−0.40213.128 1, 203.143 4白术内酯DX 718.16355.102 9355.102 4C16H18O9[M＋H]+0.13181.052 0, 145.028 7绿原酸*[27]DX 7233.55325.141 0325.143 1C18H22O4[M＋Na]+−0.53203.108 1, 188.083 1, 171.060 4, 149.059 0去甲二氢愈创木脂酸[25]R 7310.29285.279 3285.288 4C16H12O5[M＋H]+0.96256.063 0, 240.231 5金合欢素*C 7416.10209.117 7209.117 2C12H16O3[M＋H]+0.04179.094 1, 151.066 3α-细辛脑*N 757.24220.118 4220.118 0C9H17NO5[M＋H]+0.30184.094 3, 170.058 2, 142.085 5, 118.064 2, 90.054 2泛酸[28]N 7610.13303.012 9303.013 7C14H6O8[M＋H]+0.75242.988 1, 182.963 8鞣花酸[29]C

R-肉豆蔻 D-豆蔻 DX-丁香 S-手掌参 C-沉香 H-黄精 T-天门冬 N-未知来源 a-经过对照品比对 *-入血成分

R-D-DX-S-(L.) R. Br. C-H-T-(Lour.) Merr. N-unknown source a-standard comparison *-ingredients absorbed into blood

图1 正、负离子模式下暖宫七味丸提取液基峰色谱图(BPC图)

3.1.4 有机酸类化合物 本实验共从暖宫七味丸中鉴别出有机酸类化合物10种，如科罗索酸、熊果酸、异阿魏酸和绿原酸等。在正离子模式下，以科罗索酸举例进行裂解规律分析（图2-C、3-C），化合物准分子离子峰为/473.355 3 [M＋H]+，在MS2镜像图中，其主要碎片离子有/455.348 0 [M＋H－H2O]+、/437.339 9 [M＋H－2H2O]+、/249.185 0 [M＋H－C14H24O2]+、/409.344 6 [M＋H－H2O－HCOOH]+、/391.335 3 [M＋H－2H2O－HCOOH]+、/235.169 5 [M＋H－C14H24O2－CH4]+、/203.176 9 [M＋H－C14H24O2－HCOOH]+、/189.163 7 [M＋H－C14H24O2－CH2－HCOOH]+。经与对照品比对和数据库匹配，可以鉴定该化合物为科罗索酸。

3.1.5 色酮类化合物 本实验共从暖宫七味丸中鉴别出5种色酮，分别为2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基-2-(3-甲氧基-2-苯乙基)色酮、6,8-二羟基-2-(2(3-甲氧基-4-羟基苯乙基))色酮、6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、6-羟基-2-(2-苯乙基)色酮。该类化合物主要来自于沉香，易失去苯环、H2O等分子。在正离子模式下，以6-羟基-(2-苯乙基)色酮举例进行裂解规律分析，该化合物准分子离子峰为/267.066 7 [M＋H]+，主要碎片离子峰有/176.046 5 [M＋H－C7H6]+、137.022 9 [M＋H－C10H10]+和/110.035 8 [M＋H－C10H10－CO]+。经文献数据进行比对[9]可以判定该化合物为6-羟基-2-(2-苯乙基)色酮。

3.2 GC-MS检测结果

取“2.2.2”项中的暖宫七味丸氯仿提取液进行GC-MS检测，得到暖宫七味丸氯仿提取液的总离子流图（图4）。将得到化合物质谱信息导入NIST11数据库进行鉴别，并按“2.2.3”项所述的方法进行定量。结果共确定了35个化合物，占总峰面积的85%，包括有肉豆蔻酸、角鲨烯、邻苯二甲酸二甲酯、-柠檬烯等，结果见表2。

图3 瓜氨酸(A)、沉香四醇 (B)、科罗索酸 (C) 的二级质谱图及其对照品比对镜像图

3.3 暖宫七味丸血中移行成分研究

通过分析大鼠空白血浆、给予大鼠暖宫七味丸后的血浆以及暖宫七味丸提取液的总离子流图，比较药液（图1）和空白对照血浆、给药组血浆的保留时间以及二级碎片，从中鉴别出19个血中移行成分，结果见图5和表1。

3.4 暖宫七味丸的药动学研究

沉香四醇是沉香中的主要成分，绿原酸和科罗索酸均来源于丁香，为研究其在体内的代谢行为，建立了暖宫七味丸中沉香四醇、绿原酸、科罗索酸的HPLC-MS/MS检测定量方法，并以此方法评价大鼠血浆中3种成分的体内药动学行为，为后续暖宫七味丸的体内研究提供参考。

图4 暖宫七味丸挥发性成分的总离子流色谱图

表2 暖宫七味丸挥发油GC-MS鉴定结果

Table 2 GC-MS identification results of volatile oil in Nuangong Qiwei Pill

峰号tR/minCAS分子式化合物相对分子质量匹配值相对含量/% 126.27544-63-8C14H28O2肉豆蔻酸228.219930.67 235.24111-02-4C30H50角鲨烯410.39994.66 331.13629-78-7C17H36正十七烷240.28971.26 431.96646-31-1C24H50正二十四烷338.39971.06 521.68131-11-3C10H10O4邻苯二甲酸二甲酯194.06964.65 63.58108-88-3C7H8甲苯92.069523.38 710.105989-27-5C10H16D-柠檬烯136.12950.96 828.1857-10-3C16H32O2棕榈酸256.24952.59 929.85112-80-1C18H34O2油酸282.26952.69 1033.52629-92-5C19H40癸烷268.31950.32 1137.5757-88-5C27H46O胆固醇386.36950.12 1219.7097-53-0C10H12O2丁香酚164.08930.33 1339.5655103-80-5C22H35BrO21-溴-20-甲基孕烷-5-烯-3β-醇395.19930.27 148.6662-53-3C6H7N苯胺93.06912.41 1514.0717865-32-6C9H20O2Si环己基二甲氧基甲基硅烷188.12910.71 1622.7496-76-4C14H22O2,4-二叔丁基苯酚206.17911.43 1729.35629-94-7C21H44二十烷296.34910.38 1832.26119-47-1C23H32O22,2'-亚甲基二(4-甲基-6-叔丁基苯酚)340.24910.47 1933.20117-81-7C24H38O4邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯390.28911.00 2022.2017312-82-2C13H284,6-二甲基十一烷184.22900.06 2124.006627-88-9C11H14O34-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚194.09900.07 2230.267225-66-3C19H407-己基十三烷268.50870.68 2322.304292-19-7C12H25I1-碘十二烷296.23860.98 2434.676422-86-2C24H38O4对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯390.28830.13 2535.9720797-80-2C19H14O7曲霉毒素354.07810.20 265.65106-42-3C8H10对二甲苯106.08800.79 2710.987045-71-8C12H262-甲基十一烷170.20800.47 2817.441000309-14-1C6H14O3S亚硫酸己基戊酯236.15800.75 2925.1513909-73-4C11H14O42',3',4'-三甲氧基苯乙酮210.09800.23 3023.0062238-11-3C13H282,3,5-三甲基癸烷184.22780.14 3135.506627-88-9C11H14O34-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚194.09760.39 3216.981000309-32-8C₁₂H₂₂O₄草酸异己基戊酯244.17720.16 3327.916386-38-5C18H28O33-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸甲酯292.20720.08 3428.091000309-17-9C19H14O7十二烷基磺酸丁酯306.22720.27 3529.73544-76-3C16H34十六烷226.27720.28

图5 正离子模式下暖宫七味丸入血成分色谱图

Fig. 5 Chromatogram of blood components of Nuangong Qiwei Pill under positive ion mode

3种成分的血药浓度-时间曲线如图6所示。科罗索酸在给药后出现双峰，可能与肝肠循环或者在胃肠道有不同的吸收部位有关。

4 讨论

本研究首次采用UPLC-Q-TOF-MS技术从暖宫七味丸中快速分析鉴定出76个化学成分，采用GC-MS技术对蒙药暖宫七味丸中的挥发性成分进行分析鉴定，通过数据库比较共鉴定出35个化合物。经大鼠ig给药后检测其入血成分，以文献、标准比对、质谱数据库相结合的方式，共分析鉴定出19个吸收进入血中的原型成分，包括沉香四醇、6-甲氧基-2-(3′-甲氧基-2-苯乙基)色酮、2-(2-苯乙基)色酮、科罗索酸、肉豆蔻醚、肉豆蔻木脂素、6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、6-羟基-(2-苯乙基)色酮、邻苯二甲酸二丁酯、绿原酸、土木香内酯、丁香酚等。在进行了暖宫七味丸的化学物质组的辨识、入血成分的分析后，又进一步利用UPLC-QTRAP-MS技术研究其药动学，发现沉香四醇、科罗索酸和绿原酸3种成分具有较明显的药动学特征。

物质基础和药效是研究Q-Marker的重要节点，而药物成分的体内药动学行为是链接物质基础和药效的“桥梁”，对成分体内暴露情况及其药代动力学的研究能够加强物质基础和药效之间的关联性[5,30]。通过研究暖宫七味丸的化学物质组、血中移行成分、药动学，发现沉香四醇、科罗索酸和绿原酸具有很好的可测性和可追溯性。其中，沉香四醇来源于沉香，现有实验表明沉香中的2(-2-苯乙基)色酮类物质对乙酰胆碱酯酶呈不同程度的抑制作用，且沉香提取物具有镇静催眠、麻醉的作用[31]；研究表明沉香四醇是沉香中特有且有效的活性物质[32]。科罗索酸、绿原酸来源于丁香，丁香在中医上属于温里药，具有温中、暖肾、降逆的功效，在蒙医中是镇“赫依”药物，称为命脉良药[33-34]。现代研究认为丁香具有抗菌、消炎、镇痛以及对消化系统的保护作用[35]。以上这3种化学成分均表现出良好的可测性和药动学特征，可能是暖宫七味丸潜在的Q-Marker。

本研究借鉴中药Q-Marker的研究经验，经文献调研后采用LC-MS/MS及GC-MS技术对蒙药暖宫七味丸的化学物质组、血中移行成分、药动学进行研究，从可测性的角度寻找暖宫七味丸的Q-Marker，结果显示，沉香四醇、绿原酸和科罗索酸可能是暖宫七味丸潜在的Q-Marker。本研究明确了暖宫七味丸的化学物质基础及入血的原型成分，筛选出3种可能的质量标志物，为暖宫七味丸质量标准化和质量控制的指标成分选择提供了参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Quality markers of Mongolian medicine Nuangong Qiwei Pill based on “chemical composition-blood migration component-pharmacokinetics”

ZHANG Chen-chen1, 2, ZHANG Dong-xu1, 2, ZHANG Yu-feng1, 2, ZHANG Ai-jie2, DONG Shi-qi2, HAN Feng3, XING Jie-hong4, FAN Hui-rong2, LIU Xiao-chang5

1. Tianjin university of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300192, China 3. Inner Mongolia Institute for Drug Control, Hohhot 010020, China 4. Inner Mongolia Mongolian Medicine Co., Ltd., Tongliao 028000, China 5. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China

To study the chemical composition, blood migration components and pharmacokinetics and screen the potential quality markers of Nuangong Qiwei Pill (暖宫七味丸), a Mongolian medicine.The UPLC-Triple-TOF-MS/MS and GC-MS technologies were used in combination with the database and the comparison of standard products to identify the chemical composition and blood migration components of Nuangong Qiwei Pill; UPLC-Q-TRAP-MS/MS was used to study its pharmacokinetics.A total of 76 chemical components were identified by UPLC-Q-TOF-MS/MS and 35 compounds were identified by GC-MS. After intragastric administration in rats, 19 prototype components that were absorbed into the blood were identified. Among them, agarotetrol, chlorogenic acid and corosolic acid showed good testability and obvious pharmacokinetic characteristics.Agarotetrol, chlorogenic acid and corosolic acid may be potential quality markers of Nuangong Qiwei Pill due to its good measurability and traceability in chemical composition-blood migration component-pharmacokinetics analysis.

Nuangong Qiwei Pill; quality markers; chemical components; blood migration components; pharmacokinetics; agarotetrol; chlorogenic acid; corosolic acid

R284.1

A

0253 - 2670(2023)18 - 5855 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.004

2023-04-12

内蒙古自治区科技计划项目（2020GG0199）；国家重点研发计划项目（2018YFC1708203）

张晨晨，女，硕士研究生，研究方向为中药药动学。E-mail: z18340077587@163.com

樊慧蓉，女，研究员，硕士生导师，研究方向为药动学。E-mail: fanhr99@163.com

[责任编辑 王文倩]