李晴晴，黄菊，孙洋，徐赟辉，王炼，张小凤，王月月，耿志军，宋雪，左芦根，5，李静，胡建国

蚌埠医学院第一附属医院1检验科，3中心实验室，4胃肠外科，安徽 蚌埠 233004；2蚌埠医学院检验医学院，安徽 蚌埠 233030；5炎症相关性疾病基础与转化研究安徽省重点实验室，安徽 蚌埠233004

克罗恩病（CD）是一种以肠道慢性复发性炎症为主要表现的炎症性肠病（IBD），具有致残性和不可治愈性等特点［1,2］。临床上多使用生物抗炎制剂缓解CD患者的症状，但是并不能理想地控制疾病的手术率和复发率［3］。CD的发病率在我国呈现逐年升高的趋势，而发病机制不明严重阻碍了疾病诊疗水平的提高［4］。正常情况下，肠上皮细胞、细胞间紧密连接以及菌膜三者构成肠道的机械屏障，可阻止肠道内细菌及其产生的脂多糖（LPS）等有害物质损伤肠粘膜并进入血液循环［5］。然而，CD患者存在肠上皮细胞过度凋亡的病理特征，使得肠屏障结构和功能破坏而参与加重肠炎进展［6-8］。因此，寻找以抑制肠上皮细胞凋亡并保护肠屏障的新型药物将为CD诊疗提供新的参考。乙酰紫堇灵（Ace）是从中药紫堇中提取的生物碱活性成分，具有抗炎作用，被证实可以抑制神经元细胞凋亡进而缓解帕金森模型小鼠的症状［9］，提示其可能具有潜在的抗肠炎和肠上皮细胞凋亡的作用，然而目前Ace在CD中的作用尚未见报道。本研究拟采用TNBS诱导的小鼠结肠炎模型，观察Ace对CD样肠炎的作用，以肠上皮细胞凋亡和肠屏障损伤为研究重点，分析Ace的作用途径，并进一步使用脂多糖诱导的结肠类器官凋亡模型及网络药理学分析等技术，探究Ace调控上皮细胞凋亡保护肠屏障的作用机制，以期为CD临床治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

6～8周龄，体质量19～25 g的C57BL/6品系雄性野生型小鼠（WT）40只，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。饲养环境为无特定病原菌（SPF），温度22～25 ℃，相对湿度50%～70%，昼夜周期12 h/12 h，自由饮食。本研究通过蚌埠医学院第一附属医院动物伦理委员会审查（伦理批准号：[2021]第226号）。

Acetylcorynoline（上海源叶科技有限公司）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，Sigma）、脂多糖（LPS，Sigma）及牛血清白蛋白（BSA，Sigma）；HE染色试剂盒（索莱宝科技有限公司）；ZO-1、Claudin-1、C-caspase3、Bax、Bcl-2、AKT、PI3K、p-AKT、p-PI3K和β-actin（Abcam）；740Y-P（MCE）；细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒（碧云天）；Tunel细胞凋亡检测试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）；DMEM-F12（gibco）；D-PBS（STEMCELL）；温和细胞解离试剂（GCDR，STEMCELL）、小鼠类器官培养基（STEMCELL）、鼠类器官生长因子（STEMCELL）、基质胶（康宁）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及处理 将WT小鼠随机分为对照组（WT组）、模型组（TNBS组）和Ace干预组[Ace-10组（10 mg/kg Ace）、Ace-20组（20 mg/kg Ace）和Ace-40组（40 mg/kg Ace）]，8只/组。TNBS组和Ace干预组小鼠进行TNBS造模，过程简述如下：小鼠麻醉后（1%戊巴比妥钠，腹腔注射，40 mg/kg），将聚乙烯软管（3.5 F）连接1 mL注射器，经肛门缓慢置入直肠（约4 cm），推注100 μL 的2.5%TNBS酒精溶液（5%TNBS与无水乙醇溶液1∶1混合），并倒立4 min。造模后，Ace干预组小鼠每日给予Ace灌胃（10、20、40 mg/kg，0.2 mL，1次/d，连续6 d），其余两组每日均予等量生理盐水灌胃。造模后第7天取检结肠组织：一部分用10%福尔马林中固定用于组织学分析；另一部分直接冻存于液氮中，用于分子生物学检测。

1.2.2 结肠类器官提取、培养及干预 选取4只WT鼠进行结肠类器官的提取。简述如下［10］：处死小鼠，取出结肠，剔除肠管附着的筋膜、脂肪和粪便。将组织转移至EP管中，剪碎，进入预冷的D-PBS，吹打混匀后，待自然沉降后弃上清，重复冲洗数十次。加入GCDR，在4 ℃、70 r/min的摇床上孵育30 min，经4 ℃、2500 r/min离心5 min后弃上清。使用基质胶混合液在24孔板内进行点胶。将24孔板移至37 ℃、5%CO2培养箱，孵育0.5～1 h。待胶凝固，加入小鼠肠类器官培养基。实验随机分为4组：Control组、脂多糖组、脂多糖+Ace组（Ace组）及脂多糖+Ace+740Y-P组（Ace+740Y-P组），Control组为正常培养的类器官；脂多糖组为类器官经脂多糖（100 μg/mL）干预24 h；Ace组为类器官经脂多糖（100 μg/mL）和Ace（20 μmol）同时干预24 h［11,12］；Ace+740Y-P 组为类器官经脂多糖（100 μg/mL）、Ace（20 μmol）和740Y-P（30 μg/mL）同时干预24 h［13］。收集各组类器官用于后续检测。

1.2.3 疾病症状、结肠长度及肠炎组织学评估 每日记录各组小鼠体质量；取检当天采用肠炎疾病活动度（DAI）评估小鼠疾病症状，DAI=（体质量指数+大便形状+出血情况）/3，分值范围为0～4分，评分越高提示肠炎临床症状越重［14］；取检时测量各组小鼠结肠长度；对小鼠结肠组织切片进行常规HE染色及结肠组织病理学评分，该量表评分范围为0～4分，0分为无炎症；1分为少量炎性细胞浸润固有层；2分为单核细胞浸润导致隐窝分离和轻度粘膜增生；3分为大量炎性细胞浸润导致粘膜结构紊乱，杯状细胞丢失和明显的粘膜增生；4分为隐窝脓肿和溃疡，分值越高代表肠炎越重［15］。

1.2.4 评估Ace对肠屏障功能的影响（1）石蜡切片免疫荧光染色：将固定后的结肠组织进行石蜡包埋，制作4 μm厚度切片，切片经烤片、脱蜡水化、抗原修复、5%BSA封闭后，孵育一抗（Claudin-1，1∶400）和荧光二抗，滴加DAPI染核，70%甘油封片；（2）结肠类器官免疫荧光染色：结肠类器官经4%多聚甲醛固定、30%蔗糖溶液孵育、1%Triton破膜、5%BSA封闭、孵育Claudin-1抗体和荧光二抗，滴加DAPI染核，使用明胶溶液重悬类器官，置于共聚焦中采集照片；（3）Western blot检测：依据细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒操作说明书，提取小鼠结肠组织及结肠类器官中总蛋白和细胞膜蛋白，经SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、孵育一抗（ZO-1、Claudin-1和β-actin，1∶1000）和HRP标记的二抗，再经ECL超敏发光液显色和采集图片。最后，通过ImageJ软件分析目的条带的灰度值，并计算蛋白相对表达量。

1.2.5 评估Ace对肠上皮细胞凋亡的影响（1）Tunel染色：根据Tunel检测试剂盒操作步骤对脱蜡水化后的结肠组织切片染色。随机挑选5个不重复视野，计算细胞凋亡率：细胞凋亡率（%）=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%；（2）凋亡相关蛋白的Western blot 检测：Ccaspase3、Bax和Bcl-2（1∶1000），步骤同上。

1.2.6 网络药理学分析 筛选Ace潜在作用靶点及CD相关靶点：首先从PubChem 数据库获得Ace 的SMILES结构式，将其导入Swiss Target Prediction数据库［16］，以可能性（probability＞0）为限制条件筛选Ace潜在作用靶点。利用GeneCards数据库检索CD相关靶点并剔除得分较低的靶点。将筛选得到的Ace潜在作用靶点及CD相关靶点导入Venny 2.1 在线工具绘制韦恩图，得到二者共同靶点基因。将交集靶点导入String数据库，得到蛋白互作网络图（PPI）。最后采用DAVID数据库对交集基因进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，限定物种为“Homo Sapiens”，并将KEGG富集的通路选择前15条进行可视化处理。

1.2.7 评估Ace体内外干预对PI3K-AKT信号通路的影响 Western blot检测AKT、PI3K、p-AKT和p-PI3K（1∶1000）的蛋白表达量，方法同实验方法1.2.4 中Western blot检测。

1.2.8 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行数据分析，每组试验至少重复3次，且所有数据均以均数±标准差表示。两组之间的比较采用t检验（参数）或Mann-Whitney test（非参数）。当P＜0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ace干预可改善TNBS模型小鼠的疾病症状

与TNBS组相比，Ace干预后小鼠的平均体质量逐渐增加（图1A）和DAI评分显著降低（P＜0.05，图1B）。根据体质量变化和DAI评分的结果发现，20 mg/kg的Ace给药剂量治疗结肠炎的效果最佳（图1）。

图1 Ace干预对TNBS模型小鼠疾病症状的影响Fig. 1 Effect of acetylcorynoline (Ace) on disease symptoms of TNBS-induced mice.A: Changes of body weight.B:Changes of DAI scores.*P＜0.05 vs WT group.#P＜0.05 vs TNBS.

2.2 Ace干预可缓解TNBS模型小鼠的肠道炎症反应

相比于TNBS组，Ace-20组小鼠结肠长度明显增加（P＜0.05，图2A、B）。HE 染色和组织学评分显示，Ace-20组小鼠肠炎组织学评分减低（P＜0.05，图2C、D）。

图2 Ace干预对TNBS模型小鼠肠道炎症的影响Fig. 2 Effect of acetylcorynoline(Ace)on intestinal inflammation in TNBS mice.A,B:Comparison of colon length among different groups.C:HE staining of the colon tissue.D:Histopathological score of the colon.*P＜0.05 vs WT group.#P＜0.05 vs TNBS group.

2.3 Ace干预可保护TNBS模型小鼠肠屏障结构

TNBS组小鼠结肠组织中Claudin-1存在缺失及移位，而经Ace 治疗后得到明显改善（图3A）。Western blot检测结果表明，与TNBS组相比，Ace-20组小鼠结肠组织及细胞膜中Claudin-1和ZO-1的蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05，图3B～E）。

图3 Ace干预对TNBS模型小鼠肠屏障结构的影响Fig. 3 Effect of acetylcorynoline(Ace)on intestinal barrier structure of TNBS mice.A:Immunofluorescence assay of claudin-1 expression in the colon of the mice. B, C: Western blotting of claudin-1 and ZO-1 expressions in the colon tissues.D,E:Western blotting of cell membrane proteins of claudin-1 and ZO-1.*P＜0.05 vs WT group.#P＜0.05 vs TNBS group.

2.4 Ace干预减少TNBS模型小鼠肠上皮细胞凋亡

Tunel检测发现，与TNBS组相比，Ace-20组结肠组织中肠上皮细胞凋亡的数量减少（P＜0.05，图4A、B）。Western blot结果表明，Ace-20组结肠组织中抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达上调，而凋亡蛋白C-caspase3 及Bax的水平降低（P＜0.05，图4C、D）。

图4 Ace干预对TNBS模型小鼠肠上皮细胞凋亡的影响Fig. 4 Effect of acetylcorynoline(Ace)on intestinal epithelial cell apoptosis in TNBS mice.A:TUNEL staining of the colon tissue.B:Apoptosis rate of intestinal epithelial cells.C,D:Western blotting of C-caspase3,Bax and Bcl-2.*P＜0.05 vs WT.#P＜0.05 vs TNBS.

2.5 Ace干预保护脂多糖诱导的结肠类器官屏障结构

免疫荧光结果显示，脂多糖组结肠类器官中Claudin-1存在缺失，而经Ace干预后明显改善（图5A）。与脂多糖组相比，Ace组结肠类器官组织和细胞膜中Claudin-1 和ZO-1 的蛋白表达明显升高（P＜0.05，图5B～E）。

图5 Ace干预对脂多糖诱导的肠类器官屏障结构的影响Fig. 5 Effect of Ace on barrier structure of LPS-induced colonic organoid. A: Immunofluorescence assay of claudin-1 in colonic organoid. B, C: Western blotting of claudin-1 and ZO-1 in colonic organoid tissues. D, E: Western blotting of membrane proteins of claudin-1 and ZO-1.*P＜0.05 vs Control group.#P＜0.05 vs LPS group.

2.6 Ace干预减少脂多糖诱导的结肠类器官上皮细胞凋亡

与脂多糖组相比，Ace组抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著上调，而凋亡蛋白C-caspase3及Bax的表达则显著降低（P＜0.05，图6A、B）。

2.7 Ace治疗CD的交集靶点及KEGG通路富集分析

Venny图显示，Ace和CD潜在交集作用靶点共有45个（图7A），并导入String数据库得出PPI网络图（图7B）。此外，KEGG通路富集预测分析表明，PI3K-AKT信号通路与Ace治疗CD具有相关性（图7C）。

图7 网络药理学分析结果Fig. 7 Results of network pharmacological analysis.A:Venn diagram of CD gene-Ace target genes.B:PPI network diagram.C:KEGG enrichment pathways of the intersection targets ofAce and CD.

2.8 Ace减少肠上皮细胞凋亡可能与调控PI3K-AKT通路有关

相对于TNBS组小鼠（图8A、B）和脂多糖诱导的结肠类器官（图8C、D），经Ace干预后Ace组中p-PI3K及p-AKT蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。

图8 Ace干预对体内和体外PI3K/AKT通路的影响Fig. 8 Effect of Ace on the PI3K/AKT pathway in both the in vivo and in vitro models.A,B:Western blotting of PI3K,p-PI3K,AKT and p-AKT expressions in the in vivo model.C, D: Western blotting of PI3K,p-PI3K,AKT and p-AKT expressions in the in vitro model.*P＜0.05 vs WT and Control groups.#P＜0.05 vs TNBS and LPS groups.

2.9 Ace可通过抑制PI3K-AKT信号通路减少肠上皮细胞凋亡

与Ace组相比，经PI3K-AKT激活剂740Y-P干预后，p-PI3K 及p-AKT 的蛋白表达水平增加（P＜0.05，图9A、B），Ace+740Y-P组结肠类器官中Bcl-2的表达降低，而C-caspase3 和Bax 的表达水平上调（P＜0.05，图9C、D）。

图9 PI3K-AKT信号通路激活剂对Ace治疗肠上皮细胞凋亡的影响Fig. 9 Effect of PI3K-AKT signaling pathway activator on Ace-treated intestinal epithelial cell apoptosis. A, B: Western blotting of PI3K,p-PI3K,AKT and p-AKT expressions in vitro. C, D:Western blotting of C-caspase3,Bax and Bcl-2 expressions in vitro.*P＜0.05 vsAce.

3 讨论

目前CD仍无法治愈，临床上还是以药物治疗为主，但是存在大量副作用［17］。因此，寻找新的且安全有效的药物仍是当前探索CD治疗的主要策略［18-20］。本文通过体内与体外研究，证实Ace可能是通过抑制PI3K/AKT信号的激活减少肠上皮细胞凋亡，进而保护肠屏障和发挥抗肠炎的作用。

中药因其整体性治疗及安全性等优势，有望在CD治疗中展现出良好的应用前景［21］。近年来，有研究报道中药成分对于治疗TNBS模型小鼠CD样肠炎有较好的缓解作用。例如，绿茶多酚（GTP）是绿茶中的天然药效成分之一，可发挥抗炎及肠粘膜屏障结构保护作用［22］；党参总皂苷（TSC）是党参中重要的活性成分之一，对TNBS诱导的大鼠肠粘膜损伤具有显著的保护作用［23］。Ace是中药紫堇中的生物碱成分，具有抗炎作用，可显著抑制LPS刺激树突状细胞（DC）分泌TNF-α和IL-6等炎性因子［24］；在小鼠实验性肝损伤时，紫堇灵及乙酰紫堇灵可减轻肝脏损害程度，尤以乙酰紫堇灵作用最为显著［25］。Ace的抗炎作用表明其可能在CD中具有潜在的治疗价值。基于此，本文首次应用Ace探究其在TNBS模型小鼠肠炎中的作用效果。本文发现，Ace干预后结肠炎小鼠的体质量、结肠长度、DAI和肠炎评分得到了改善，以及结肠组织几乎未见红肿和炎症细胞的浸润，这些数据表明Ace可缓解CD样结肠炎。CD患者常伴有肠屏障损伤，且越来越多的研究证明肠屏障结构损伤和功能障碍影响肠炎进展［26］。于是，我们使用TNBS小鼠和脂多糖诱导的结肠类器官模型，证实Ace改善了结肠组织和类器官中Claudin-1缺失和移位，且促进Claudin-1和ZO-1的表达水平。以上结果均表明Ace具有抗肠炎及保护肠屏障的作用，但是调控机制不明。

细胞凋亡是维持肠上皮细胞正常功能的重要环节，但在病理状态下肠上皮细胞的异常凋亡会破坏肠粘膜的完整性和屏障功能［27,28］。研究显示，CD患者肠上皮细胞凋亡率显著增加［29］。因此，抗上皮细胞凋亡可作为改善CD肠屏障功能受损的一种干预模式。有文献报道乙酰紫堇灵可能通过降低egl-1的表达抑制细胞凋亡途径，进而减少神经元细胞的凋亡［9］。在本研究中，我们探讨了Ace是否通过减少肠上皮细胞凋亡，进而发挥保护TNBS模型小鼠肠屏障的作用。体内外实验数据显示，Ace干预显著抑制肠上皮细胞凋亡，促进Bcl-2的表达量，且抑制C-caspase3及Bax的表达。以上结果均提示Ace干预可减少肠上皮细胞凋亡，这可能是Ace发挥对肠屏障保护作用的途径之一，但是Ace抑制肠上皮细胞凋亡的机制有待进一步探索。

基于网络药理学分析技术探究Ace抗肠上皮细胞凋亡进而改善肠屏障可能的作用机制。通过数据库分析最终得到45个Ace和CD的交集靶点，KEGG信号通路富集分析发现PI3K/AKT信号通路与Ace治疗CD具有一定的相关性。PI3K/AKT信号通路能够参与细胞凋亡、自噬和增殖等细胞生物学过程［30,31］，且越来越多的证据表明PI3K/AKT参与CD疾病进展。有研究发现原花青素B2（PCB2）可能通过抑制肠道PI3K/AKT信号途径对TNBS结肠炎模型小鼠发挥抗炎及肠粘膜功能和结构的保护作用［32］；黄芪苷（Baicalin）可通过抑制PI3K/AKT信号通路减少肠上皮细胞凋亡，增加紧密连接蛋白的表达进而减轻TNBS诱导的结肠炎［33］。因此，我们推测Ace可能通过调控PI3K/AKT信号通路减少肠上皮细胞凋亡，进而改善肠屏障功能。通过Western blot验证发现，经Ace干预后结肠组织和结肠类器官中的p-PI3K和p-AKT蛋白的表达显著降低。体外上调PI3KAKT信号通路后，p-PI3K和p-AKT蛋白的表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低，而凋亡蛋白C-caspase3及Bax的表达则显著升高。以上结果均提示，Ace可通过抑制PI3K-AKT信号通路发挥对TNBS模型小鼠肠炎和肠屏障功能的保护作用。

本研究具有一定的潜在临床应用价值，不仅扩充了Ace抗肠上皮细胞凋亡的生物学功能及机制，也扩大了Ace治疗疾病的范围，为CD的临床药物治疗提供了重要参考。

本研究还存在一些不足：我们使用的是TNBS诱导的小鼠结肠炎模型，但目前还没有更准确的有关CD的动物模型；在该研究中发现Ace可通过减少肠上皮细胞凋亡保护肠屏障，但不排除Ace也可能通过其他作用途径发挥抗肠炎的作用；Ace抑制肠上皮细胞凋亡可能与抑制PI3K/AKT信号激活有关，但其也可能涉及其他的调控机制。

综上所述，Ace可能通过抑制PI3K/AKT信号的激活，抑制肠上皮细胞凋亡，进而保护肠屏障受损和改善TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎。