袁正 周春阳

角膜在眼球光学系统中起着至关重要的作用,角膜疾病是导致失明的主要原因之一。目前,治疗角膜盲的主要方法是角膜移植,而用于移植的角膜主要来源是器官捐献,不足以满足临床需求。供体角膜的严重短缺推动了角膜替代物的研究。随着3D打印技术的迅速发展和进步,目前在眼科和眼科护理等领域发挥着重要的作用,如制造眼眶植入物、眼球假体等定制产品。3D生物打印技术(3D bio-printing technology)是一项广泛应用于再生医学的新兴技术。该技术使用由活细胞、生物材料或活性生物分子组成的生物墨水,通过计算机辅助控制在空间逐层精确排列来制造具有生物活性的组织或器官替代物。3D生物打印的出现,使获得个性化的角膜植入物和具有可控结构与设计的单层或多层角膜等效物成为可能,是一种很有前景的角膜替代方法。预计在不久的将来,将有更多的眼科医生和其他临床医生使用这项技术。

1 用于3D生物打印的材料

由于天然组织微环境的复杂性,精确构建仿生微环境仍然是一个挑战。3D生物打印系统能够产生微米级仿生微结构和微环境。水凝胶、纤维素等材料作为构建仿生微环境的关键构件,需要满足印刷适宜性好、印刷过程变形小以及对细胞友好和快速凝胶化的要求。最重要的是,水凝胶应该提供引导细胞构建自然微环境的平台,并且以精确和近生理的方式调节细胞的增殖和分化。

1.1 藻酸盐水凝胶

藻酸盐水凝胶是一种天然多糖,通常来自各种藻类。具有成本低、生物相容性好、离子凝胶化速度快等优点,已成为3D生物打印的理想生物墨水来源,目前已应用于血管组织、骨和软骨的打印。然而,缺乏细胞粘附性、生物降解性不稳定以及印刷适宜性差限制了藻酸盐水凝胶生物墨水的应用。这种水凝胶中的细胞不能降解周围的藻酸盐凝胶基质,导致它们始终保持在低增殖和未分化状态。Wu等[1]通过添加柠檬酸钠并搭载人角膜上皮细胞获得了可降解的细胞负载组织结构。该结构稳定性好,细胞可表现出更高的增殖率且存活率高达90%以上。Tabriz等[2]开发了一种新的3D生物打印技术,以生产更复杂的藻酸盐水凝胶结构。通过将藻酸盐水凝胶的交联过程分为三个阶段来实现:一次钙离子交联剂用于凝胶的印刷适宜性;二次钙离子交联剂用于藻酸盐水凝胶在印刷后的刚性;三次钡离子交联剂用于藻酸盐水凝胶在培养介质中的长期稳定性。为了确保该生物打印技术的可行性,首先打印了简单的3D结构,然后成功打印了分支血管结构等复杂3D结构。

Olate-Moya等[3]通过微挤压工艺开发了用于3D打印的生物共轭水凝胶纳米复合油墨,提高了生物相容性和印刷性。这种水凝胶是基于与明胶和硫酸软骨素生物结合的可光交联性藻酸盐,以模拟软骨细胞外基质;而纳米填料是基于氧化石墨烯,以增强印刷性和细胞增殖。结果表明,在水凝胶墨水中加入氧化石墨烯显著提高了3D打印支架的形状保真度和分辨率。此外,由于氧化石墨烯液晶的模板作用,纳米复合油墨在3D打印过程中还会产生各向异性的线条。人脂肪组织来源的间充质干细胞(human adipose tissue derived stem cells,hASCs)的体外增殖实验表明,生物偶联支架的细胞增殖率高于纯藻酸盐,其中纳米复合材料的细胞增殖率最高。第7天hASCs在不同支架上完全存活。值得注意的是,用纳米复合水凝胶墨水制备的支架能够引导细胞沿着3D打印线的方向增殖。28天后的免疫染色显示,生物结合的藻酸盐水凝胶基质可在不含外源性促软骨生成因子的情况下诱导成软骨细胞分化。

1.2 甲基丙烯酸酯明胶

基于甲基丙烯酸酯明胶(gelatin methacrylate,GelMA)的水凝胶在组织工程中作为潜在的可植入材料受到了极大的关注。由于不同的自然组织对机械力的反应不同,理想的植入材料需要与靶组织的机械性能非常匹配。研究表明,GelMA水凝胶有助于缓解角膜基质纤维化现象,减少纤维化导致的角膜屈光力损失。但目前GelMA水凝胶的应用仍受到GelMA低机械强度和物理性质的限制。许多研究详细描述了将各种生物材料加入到GelMA水凝胶中,以调整其各种性能,例如物理强度、化学性质、导电性,并促进细胞负载和加速组织修复。

Farasatkia等[4]开发了基于丝素纳米纤维(silk nanofibrils,SNF)和GelMA的透明薄膜用于角膜组织工程。通过改变SNF与GelMA的体积比,可以调节薄膜的力学性能、透明度、降解速率和溶胀比。其中,SNF/GelMA的最佳配比为3:7,可具有较高的透明性,透光率可达85%以上,亲水性和力学性能接近天然角膜基质。细胞培养研究还证明了SNF/GelMA膜支持基质细胞附着、扩散和增殖的能力。Yin等[5]使用3D生物打印将5%(w/v)细胞负载的GelMA生物墨水精确沉积到具有高细胞活性的受控微结构中。通过在GelMA生物墨水中加入明胶,实现了明胶快速可逆热交联和GelMA不可逆光交联的两步交联法。成功地将5%(w/v)的GelMA和8%(w/v)的明胶打印成3D结构,提高了生物打印后的形状逼真度。通过骨髓干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)的体外培养和细胞打印,证明了5/8%(w/v)的GelMA/明胶生物墨水的细胞活性。BMSCs在5/8%(w/v)的GelMA/明胶支架上的铺展面积较大,打印后BMSCs的存活率达90%以上。

1.3 其他材料

许多基于天然聚合物的生物墨水均可用于3D生物打印,如多糖甲基纤维素、琼脂、脱细胞基质等。Kim等[6]以部分氧化透明质酸盐(oxidized hyaluronate,OHA)和乙二醇壳聚糖(glycol chitosan,GC)为原料,在己二酰肼(adipic acid dihydrazide,ADH)存在下,设计了一种自愈合水凝胶,具有再生软骨的潜力。OHA/GC/ADH水凝胶的自愈合能力归因于凝胶中两个动态可逆的共价交联键,包括OHA与GC之间通过席夫碱反应得到的亚胺键,以及OHA与ADH反应形成的酰肼键。OHA/GC/ADH水凝胶用于打印3D结构时不需要任何凝胶后或额外的交联化过程,聚合物的浓度和相对分子质量是影响自愈合水凝胶流动性和力学性能的关键参数。Ji等[7]以1,4-丁二醇和碳酸二甲酯为原料,通过本体缩聚反应成功地制备了聚1,4-碳酸丁酯(poly 1,4-butylene carbonate,PBC),并评估了PBC在熔融沉积成型(fused deposition modeling,FDM)中的适用性。该研究将PBC在150℃以上的加热室中熔化,然后施加压力从打印喷嘴流出并在室温下固化,形成3D支架结构。通过控制FDM机的温度和压力,可以得到与程序设计完全匹配的3D支架,且PBC支架具有良好的生物相容性。

2 载干细胞打印角膜组织

脂肪干细胞是间充质干细胞的一种亚型,具有低侵入性、易获得的重要优势。其具备分化为多种细胞系的潜能,可表现出免疫调节特性,并通过分泌营养因子促进组织再生。研究表明,hASCs可用于再生人类角膜的上皮层、基质层和内皮层[8]。

Sorkio等[9]使用人类干细胞和激光辅助3D生物打印来制造模拟角膜组织。人胚胎干细胞来源的角膜缘上皮干细胞(human embryonic stem cell derived limbal epithelial stem cells,hESC-LESCs)作为打印上皮样结构的细胞源,而hASCs用于构建层状基质样结构。重组人层粘连蛋白和人源性I型胶原蛋白作为功能性生物墨水的基质。共打印了三种类型的角膜结构:包括使用hESC-LESCs的层状角膜上皮;使用无细胞生物墨水和hASCs交替的角膜基质层;最后是具有基质和上皮的双层结构。两种细胞在打印后都保持了良好的活性。打印后的hESC-LESCs显示上皮细胞形态、Ki67增殖标记物的表达以及角膜前体标记物p63α和p40的共同表达。重要的是,打印的hESC-LESCs形成了一层复层上皮,顶端表达CK3,基础表达祖细胞标志物。3D生物打印的基质结构与天然角膜基质组织一致,并显示I型胶原阳性标记。3D打印的基质构建物植入猪角膜器官中7天后,植入物附着在宿主组织上,并有hASCs从打印结构迁移的迹象。该研究表明使用人类干细胞,可以成功地制造出与天然角膜组织结构相似的3D生物打印组织。

Arnalich-Montiel等[10]测试了人脂肪干细胞移植到兔角膜基质中的生物安全性和免疫原性。脂肪干细胞在移植后10周,仍可保持其形状,并在不破坏其组织学模式的情况下混合在基质中,没有引起免疫反应。此外,即使脂肪干细胞在基质中形成一层不连续层时,透明度仍然保持不变。 Espandar等[11]研究表明,人脂肪干细胞可在兔角膜基质内成功生长,并能表达人角膜特异性蛋白。Alio等[12]将hASCs注入脱细胞人角膜基质中进行再细胞化,然后植入兔角膜基质内,评估了移植物的生物整合、干细胞活性和特异性蛋白的表达。结果表明,hASCs体外具有良好的再细胞能力,可在移植物内存活,并向有功能的角质形成细胞分化。植入后3个月移植物仍保持透明,且没有任何排斥迹象。除此之外,还有研究团队[13]提出了将hASCs定向分化为人角膜内皮细胞(human corneal endothelial cells,hCECs)的方案。进一步拓宽了自体眼外来源的细胞类型,可用于临床治疗角膜内皮缺乏症。

3 载上皮细胞打印角膜组织

角膜神经、上皮和基质之间的相互作用对于维持健康的角膜是必不可少的。Wang等[14]构建了一个包括上皮、基质和神经的3D角膜组织模型。使用丝蛋白薄膜作为支架支撑角膜上皮和基质层,而周围的丝质多孔海绵则支持神经元的生长。神经元支配上皮层和基质层,并改善组织的功能和生存能力。在体外模拟出角膜组织的气液界面环境,对上皮成熟度产生了积极的影响。Gosselin等[15]设计了一个以丝蛋白生物材料为支架的共培养系统,研究了人角膜上皮细胞和人角膜基质干细胞在该培养体系中向角膜上皮细胞和基质细胞的生长和分化。结果表明,丝质支架与细胞兼容,可以形成透明的3D组织系统。此外,还研究了体外培养体系中人脐静脉内皮细胞和人胚胎干细胞的增殖分化作用。与单纯的角膜上皮细胞和角膜基质细胞相比,这两种细胞类型在共培养体系中表现出更完整的分化和生长。角膜上皮丝膜结合了大量的IV型胶原,角膜上皮和基质蛋白表达和转录水平的增加,表明每种细胞类型的分化明显。

He等[16]将GelMA和长链聚乙二醇二丙烯酸酯(poly ethylene glycol diacrylate,PEGDA)混合形成双组分油墨,利用光引发共聚后的长链PEGDA结晶交联对GelMA水凝胶起到增韧作用,结合数字光处理印刷技术,可打印不同机械强度的程序化PEGDA-GelMA物件。印制的PEGDA-GelMA水凝胶支持细胞的黏附、增殖、迁移,同时表现出较高的透光率,以及适当的溶胀度、营养物质的渗透率和降解率。由负载兔角膜上皮细胞的上皮层和兔脂肪间充质干细胞的纤维基质层组成的双层穹顶状角膜支架具备高精确度和可处理性。这种双层细胞负载的角膜支架被应用于兔角膜移植。术后显示角膜缺损区有效封闭、再上皮化和基质再生。3D打印角膜支架的微结构与上皮和基质层中细胞的精确定位相结合,为角膜再生提供了最佳的地形学和生物学微环境。

4 载基质细胞打印角膜组织

使用载角膜基质细胞(corneal stromal keratocytes,CSK)的胶原基生物墨水和合适的支撑结构可3D打印出与自然角膜基质类似的结构,CSK在打印后第7天仍可显示出较高的细胞活力,并保持其天然的基质细胞表型。经光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)证实,3D生物打印的角膜基质等效物光学性质与天然角膜基质相似。Park等[17]将3D生物打印的脱细胞胶原片植入五只兔的角膜基质层,使用OCT对植入胶原片后的兔角膜进行了体内无创监测。术后1个月,通过对深度-强度的图像分析和苏木精-伊红染色,证实了其具备生物相容性。

为了模拟角膜基质的自然形态和功能,有研究团队制备了具有高透明度(约90%)的载基质细胞GelMA水凝胶[18]。稳定性研究表明,GelMA水凝胶在磷酸缓冲盐溶液放置21天后仍有87%的保存率。凝胶中负载的CSK在48 h的细胞存活率超过90%;培养3周后,荧光图像和扫描电子显微镜观察到水凝胶中细胞拉长并相互连接,细胞均匀分布。此外,该团队还制备了GelMA和聚甲基丙烯酸羟乙酯(poly hydroxyethyl methacrylate,pHEMA)互穿网络水凝胶作为角膜基质替代物,并进行了体内和体外实验。随着pHEMA的加入,凝胶的压缩模数显著增加。超过90%的CSK可在GelMA和GelMA-HEMA水凝胶中存活,同时合成了具有代表性的胶原蛋白和蛋白多糖,保留了细胞的功能和表型。并且细胞负载的GelMA-HEMA水凝胶在培育3周后,透明度与天然角膜相当。Mahdavi等[19]以GelMA与CSK混合作为生物墨水,利用3D生物打印出与人角膜解剖形态相似的穹顶状结构。同时对两种不同浓度的GelMA大分子聚合物(7.5%和12.5%)进行了角膜基质生物印迹试验。结果表明,12.5%浓度GelMA支架的机械强度更高,更容易处理;含水率和透光率更接近天然角膜基质组织。7天后,12.5%浓度GelMA样品中可见细长的CSK,表明细胞在支架内附着、生长和整合,细胞相容性更高。总之,负载CSK的3D打印GelMA水凝胶具有极好的透明度、足够的机械强度和高细胞存活率,模拟了角膜基质的生物和物理特性,是一种很有前景的角膜基质组织生物制造方法。

Ghezzi等[20]将基于多孔、光学透明的丝蛋白薄膜与人角膜基质干细胞(human corneal stromal stem cells,hCSSCs)相结合,通过将单层多孔丝膜堆积成正交的多层结构,制备了具有3D功能的角膜基质组织等效物。组织学切片显示,接种hCSSCs的3D组织系统中产生了细胞外基质。与2D单层丝膜系统相比,3D组织系统中的hCSSCs基因表达上调。初始基质的重塑显著提高了构建物的粘聚力和机械性能,同时在9周后保持了透明度。Kutlehria等[21]设计了高通量3D生物打印角膜等效物。将人CSK加入到优化的生物墨水中,打印出负载CSK的角膜基质等效物。结果显示,CSK在2周内保持了较高的存活率(>95%),打印的角膜结构能够保持其稳定性、完整性和透明度,且在打印的角膜中有纤维连接蛋白和肌动蛋白的表达。表明3D打印角膜基质等效物的高通量制造已经实现。

5 载内皮细胞打印角膜组织

有研究团队将培养的hCECs悬液接种于脱细胞人角膜基质层上,构建组织工程角膜内皮移植物[22]。在兔角膜内皮损伤的模型中,分别植入和不植入含hCECs的脱细胞薄层(实验组和对照组),并检测了这些移植物的功能和存活率。结果显示,hCECs在脱细胞薄层上提供了最佳且一致的内皮细胞计数密度和多边形形态,并具备主动泵送功能。术后实验组的角膜透明度逐渐恢复,而对照组的角膜混浊和水肿持续长达4周。组织学检查显示,实验组的移植物表面覆盖着人类来源的内皮细胞。表明脱细胞基质载体与hCECs体外复合移植治疗角膜内皮疾病具备可行性,可提高角膜内皮疾病患者的视觉质量。

Kim等[23]将核糖核酸酶5(ribonuclease5,RNase5)表达载体导入培养的人脐静脉内皮细胞中,获得了高表达RNase5的hCECs。作为R5-hCECs促进细胞增殖和存活的候选靶点,程序性细胞死亡蛋白4被抑制,细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E1被激活。将培养的R5-HCECs和对照的hCECs分别沉积在冻干羊膜(amniotic membrane,AM)上,采用3D生物打印技术制备RNase5载体携带hCECs的可移植羊膜移植物(R5-Graft)和仅携带hCECs的对照AM移植物(Ct-Graft)。植入兔角膜后2周开始,R5-Graft和Ct-Graft两组兔角膜的透明性都逐渐恢复;第3～4周时,R5-Graft组的角膜中央水肿明显轻于Ct-Graft组,且角膜内皮表型标志物的体外表达明显高于Ct-Graft组。该研究表明使用培养的人脐静脉内皮细胞构建的角膜内皮细胞在体内容易存活并可作为角膜内皮细胞发挥作用。此外,使用高表达RNase5的hCECs可能是获得更高的移植物细胞密度和增强移植物功能的一种选择。

6 总结与展望

3D生物打印基于数学模型和计算机断层扫描技术,可以设计并制作个性化角膜替代物。利用快速、简单、低成本、高重复性和高质量的制造工艺,根据生物力学分析、重量、结构完整性和生物相容性等方面对打印的角膜替代物进行评估,可以制作出符合自然人体角膜结构特征的高透光性的曲面薄膜。目前的研究主要使用搭载干细胞、上皮细胞、基质细胞和内皮细胞的生物墨水3D打印出具备不同生理特点的角膜组织,并已经证明了个性化设计、分析和制造角膜替代物具备可行性。随着研究的不断深入,3D生物打印的角膜替代物能够应用于临床,解决角膜供体稀缺的难题。

除此之外,3D生物打印的个性化角膜替代物有望应用于角膜屈光手术领域,矫治目前普遍存在的近视、远视和散光。传统的激光角膜屈光手术通过切削角膜组织来矫正屈光不正,受角膜厚度、角膜形态等因素的限制。而角膜透镜植入可以突破该限制,使角膜屈光手术不消融角膜组织成为可能。通过3D生物打印技术体外构建个性化的角膜基质透镜,将透镜植入受体角膜基质层间改变角膜的曲率以矫正屈光不正。当植入角膜基质层间的透镜为凹透镜时,可降低角膜的屈光力,达到矫正近视的效果。