冯世梅,徐中良

近年来,多重耐药、泛耐药鲍曼不动杆菌已呈世界性流行,其引发的感染性疾病发生率及临床致死率日趋升高[1]。鲍曼不动杆菌对抗菌药物具有多种耐药机制,主要包括产生抗菌药物灭活酶、药物作用靶位改变以及减少达到作用靶位的药量等[2]。基因组研究发现,鲍曼不动杆菌富含外排泵基因,外排泵高表达可减少菌体内药物的聚集,并提高最低抑菌浓度(MIC),在鲍曼不动杆菌耐药中发挥着重要作用[3]。替加环素是四环素类衍生的新型甘氨酰环素类抗菌药物,进入细菌后可与核糖体30S亚单位可逆性结合,抑制蛋白质的合成,进而产生抗菌活性,是临床治疗多重耐药、泛耐药鲍曼不动杆菌的少数可选药物,近年耐替加环素鲍曼不动杆菌不断被检出。2021年中国细菌耐药监测网数据显示,鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药率为2.5%。有研究表明,外排泵是鲍曼不动杆菌对替加环素产生耐药的重要原因,尤其与耐药结节细胞分化家族(RND)外排泵相关[4-5]。由于AdeABC是RND常见的外排泵,与获得性耐药相关。本文旨在对鲍曼不动杆菌AdeABC外排泵的遗传结构、表达调控、介导替加环素耐药等方面的研究进展进行综述,以期为相关研究提供参考。

1 与细菌耐药相关的外排泵

主动外排耐药机制最早由Mcmurry等[6]在1978年研究大肠埃希菌对四环素的耐药性时发现。迄今为止,多种外排泵已被证实在细菌中存在。外排泵是细菌细胞膜上的一类蛋白质,具有分布广泛和多底物的特点[7]。因此,外排泵过度表达是细菌产生多重耐药性的主要原因之一。目前根据氨基酸序列的同源性、作用底物类型以及能量利用方式等,将与抗菌药物相关的外排泵分为6个家族,包括蛋白细菌抗菌化合物外排家族(PACE)、ATP结合盒超家族(ABC)、小多药耐药家族(SMR)、主要易化子超家族(MFS)、多药与毒性化合物外排家族(MATE)以及RND[8]。除PACE为最新发现的外排泵系统,结构尚不明确外,其他家族外排泵主要由膜融合蛋白、内膜转运蛋白与外膜通道蛋白3部分组成,该结构赋予了细菌对抗菌药物耐药、参与致病活动、外排代谢物、传导信号以及维持稳态等重要功能。

2 鲍曼不动杆菌AdeABC外排泵

目前在鲍曼不动杆菌鉴定中发现了6个家族外排泵的内膜转运蛋白,其中,RND外排泵可利用H+进入细胞膜时产生的跨膜浓度梯度为外排动力将药物分子排出[9],该单一机制即可导致其对不同抗菌药物耐药。现已在鲍曼不动杆菌中鉴定出了7种RND外排泵,其中AdeABC外排泵普遍存在于鲍曼不动杆菌中[10],外排底物包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类和氟喹诺酮类等抗菌药物及某些毒物,是最早发现[11]和研究较多的鲍曼不动杆菌RND外排泵。

2.1 AdeABC外排泵的遗传结构 AdeABC外排泵是由膜融合蛋白AdeA、内膜转运蛋白AdeB和外膜通道蛋白AdeC 3部分组成,其中膜融合蛋白AdeA具有辅助内膜转运蛋白AdeB从细胞周质区、细胞内膜和细胞质中捕获外排底物的功能;内膜转运蛋白AdeB包含12个跨膜片段,可以识别与转运外排底物,为AdeABC外排泵耐药的主要因素[12],常作为流行病学的检测指标;外膜通道蛋白AdeC可利用质子泵将外排底物排出,但对耐药无本质上的影响[13]。有研究发现,AdeC在AdeABC外排泵中不是必需的,当其缺失时,AdeAB可能利用其他外膜成分实现外排底物[14-15]。

2.2 AdeABC外排泵的表达调控 AdeABC外排泵的结构基因adeABC以操纵子的形式存在于染色体基因组上,adeA和adeB以相同的方向在基因序列中连续排列被共同转录[16]。AdeABC外排泵的转录和表达受双组分调控系统AdeRS的调节,其中AdeR为DNA结合蛋白、AdeS为信号识别蛋白。双组分调控系统主要通过感应激酶的组氨酸蛋白激酶区和反应调节子的激活反应区磷酸化和去磷酸化进行信号传导[14]。双组分调控系统AdeRS也是以操纵子的形式存在,调控基因adeRS位于结构基因adeABC的上游区,分别编码反应调控蛋白AdeR和感应激酶AdeS,作用原理为感应激酶AdeS受到外界环境的刺激后,通过激活或钝化反应调控蛋白AdeR控制外排泵adeABC基因的表达[17]。一般情况下,adeABC基因在鲍曼不动杆菌中是不表达或低表达的。已有研究表明,双组分调控系统AdeRS中功能相关区域的特异性位点突变可以使adeABC基因表达增高[18],如AdeR的116位亮氨酸变为脯氨酸、AdeS的30位甘氨酸变为天冬氨酸或94位缬氨酸变为丙氨酸等[19-20]。此外,adeS中插入ISAba1转座子可突变为1个N末端截短的adeS,截短的adeS能够激活adeR,并增强adeABC基因表达[21-22]。

3 鲍曼不动杆菌AdeABC外排泵与其对替加环素耐药的关系

截至目前,食品药品监督管理局(FDA)、欧洲药敏试验标准委员会(EUCAST)及美国临床和实验室标准协会(CLSI)均未制定鲍曼不动杆菌对替加环素的体外药敏试验结果判定标准[23]。现阶段有关鲍曼不动杆菌AdeABC外排泵与其对替加环素耐药的研究,大多参考EUCAST或FDA制定的肠杆菌科对替加环素的折点判定标准,但二者又有所差异,王辉[24]推荐我国微生物实验室参照FDA的折点判定标准。

3.1 以FDA的判定标准为参考 刘红巧等[25]研究表明,在对替加环素中介(MIC为4 μg/ml)或耐药(MIC≥8 μg/ml)的鲍曼不动杆菌中均能检出adeABC基因。Ruzin等[26]和曲俊彦等[27]研究发现,替加环素中介或耐药菌鲍曼不动杆菌的adeABC基因表达水平明显高于敏感菌。Jo等[28]研究则发现,50%以上被确定为替加环素敏感(MIC≤2 μg/ml)或中介的鲍曼不动杆菌中存在异质性耐药(即某个单一分离菌株,在其培养的群体中存在着对某种抗菌药物敏感性不同的亚群),亚群中替加环素耐药可能与adeS中插入了ISAba1,导致AdeABC外排泵过度表达有关。López-siles等[29]观察到ISAba1插入突变使得鲍曼不动杆菌adeABC表达增加25倍。Yang等[30]研究认为,AdeABC外排泵的过度表达是导致医院内鲍曼不动杆菌对替加环素敏感性降低的普遍机制,同时提出鲍曼不动杆菌adeABC操纵子对替加环素耐药性可能会被一些未知机制减弱。

3.2 以EUCAST的判定标准为参考 张驰等[31]研究发现,在替加环素耐药(MIC>2 μg/ml)鲍曼不动杆菌中能检出adeABC-adeRS等RND外排泵基因及其调控基因,且adeB基因相对表达量是替加环素敏感(MIC≤1 μg/ml)鲍曼不动杆菌的23.5倍,耐替加环素鲍曼不动杆菌的MIC增加了4～16倍。Mahapatra等[32]研究表明,在替加环素耐药(MIC>0.5 μg/ml,2019年更新)鲍曼不动杆菌中adeB基因最为常见,在含有adeA、adeB、adeC、adeR和adeS基因的鲍曼不动杆菌中的替加环素平均MIC明显高于不具有这些基因的菌株,并认为上述基因均可单独对MIC增加发挥作用。

4 亚抑菌浓度替加环素对AdeABC外排泵表达的影响

外排泵的表达可由其底物诱导[33],现有少数研究表明,在亚抑菌浓度替加环素中生长的鲍曼不动杆菌,替加环素MIC并未增加,对adeABC以及AdeABC外排泵启动子的表达也无影响[34]。

5 小 结

目前,多数研究认为多重耐药鲍曼不动杆菌对替加环素的敏感性降低与adeABC基因高表达密切相关,AdeABC外排泵在鲍曼不动杆菌对替加环素耐药中发挥了主要作用[18,22,35]。但也有部分研究提示,在替加环素敏感性降低或不敏感(MIC≥2 μg/ml)的鲍曼不动杆菌中,替加环素MIC与adeABC基因表达水平无明显相关性[34],或仅有少数菌株的adeB等RND外排泵基因表达增强且上调幅度不高,推测AdeABC外排泵等RND外排泵可能仅辅助其他耐药机制促进替加环素耐药发生[21],并认为外排泵可能主要介导低水平耐药,仅作为一种耐药背景参与替加环素耐药的产生。以上差异可能与不同地理来源的鲍曼不动杆菌基因多样性、采用的体外药敏试验检测方法不一致以及替加环素折点判定存在差异等有关。

利益冲突:所有作者声明无利益冲突。