高秀蕊,孙春艳,胡冬梅,王雁群,周云,孙晶,王缨

(山东药品食品职业学院,山东 淄博 255000)

柴归夏妇安煎煮茶是医疗机构一种中药制剂,被应用临床多年,其主要成分有黄芩、柴胡、当归、白芍、川芎等,黄芩是君药。该药剂功能主治疏肝健脾、补泻兼施、寒热互调,用于肝脾不和所致的绝经前后诸证。君药黄芩具有泻火解毒、止血安胎、清热燥湿等作用[1],其代表成分为黄芩苷,本研究方法根据《中国药典》(2020年版)分析方法验证指导原则[2]和《山东省医疗机构制剂规范》的要求,以君药黄芩中的黄芩苷为指标,通过方法的系统性考察和对三批供试品的含量测定,确定并建立HPLC测定柴归夏妇安煎煮茶中黄芩苷的含量方法。

1 仪器与试药

使用的仪器与试药详见表1。

表1 使用的仪器与试药

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 选择检测波长

通过查阅2020年版药典一部[1]和文献[3-9],含黄芩的制剂中黄芩苷的含量检测方法,采用的波长多在274～280 nm之间,在波长190～800 nm扫描黄芩苷对照品溶液,确定黄芩苷的λmax=277 nm(图1),因此选择277 nm作为黄芩苷的检测波长。

图1 黄芩苷对照品紫外-可见扫描图谱

2.1.2 选择流动相

不同的制剂测定黄芩苷含量多采用甲醇(MeOH)-磷酸(H3PO4)为流动相,因此配制不同浓度配比的MeOH-H3PO4,进行考察。

经过比较流动相的分离度(R)、理论塔板数(n)、保留时间(tR),综合考虑,选择MeOH-0.3%H3PO4(体积比45∶55)作为流动相。

2.1.3 考察提取溶剂

查阅药典分别用70%EtOH、MeOH及50%MeOH作提取溶剂,用70%EtOH溶解样品的含量明显高于其它两种溶剂,因此确定70%EtOH为提取溶剂。

2.1.4 考察超声时间

设计三种超声方案,时间分别为20,30,40 min,试验测定结果为20 min含量偏低,30,40 min含量相差不大。综合结果判断,选择30 min为超声提取时间。

2.1.5 考察取样量

称取供试品质量,数值分别为0.25,0.50,0.75 g,分别向样品中加入70%的EtOH 100 mL溶解,比较测定结果相差不大,综合判断选择0.5 g为取样量。

综上,色谱条件为反相C18柱;MeOH-0.3%H3PO4(体积比45∶55)为流动相;检测λ为277 nm;40 ℃的柱温;1.0 mL/min的流速;10 μL的进样量,注入HPLC,记录色谱图。

2.2 溶液的制备

各类溶液的制备方法详见表2。

表2 各类溶液的制备方法

2.3 方法学考察[2]

2.3.1 专属性考察

分别精密量取10 μL表2中对应的溶液注入HPLC进行测定(见图2～4)观察色谱图,供试品与对照品有相对应的色谱峰,而阴性对照品则无。因此判断出药方中其他的中药成分和溶剂对测定结果没有影响。

图2 对照品HPLC图

图3 供试品HPLC图

图4 阴性对照品HPLC图

2.3.2 精密度试验

精密量取10 μL对照品溶液(表2)注入HPLC,连续6次进样,计算RSD=0.18%。结果分析显示精密度良好,符合2020年版药典的要求。

2.3.3 重复性试验

平行制备6份供试品溶液(依据表2)→按照2.1项下色谱的条件进样,利用外标法计算含量,平均含量0.411 5%,RSD=1.0%。由结果判断测定方法具有良好的重复性。

2.3.4 回收率试验

取同一批次样品(批号:20221023,黄芩苷含量为0.411 5%)约0.25g,精密称定→置于100 mL容量瓶中→加70 mL 70%的EtOH,在每份中精密加入5 mL对照品贮备液(表2),加70%EtOH溶解并稀释至刻度,平行制备6份样品液。分别精密量取10 μL制备好的样品溶液、对照品溶液注入HPLC,计算结果,回收率99.86%(RSD=1.7%)(见表3),回收率良好。

表3 加样回收率试验结果

2.3.5 线性与范围

分别精密吸取表2中对照品贮备液制成6种不同浓度的溶液:(1)1 mL置于20 mL容量瓶;(2)2 mL置于25 mL 容量瓶;(3)5 mL置于50 mL容量瓶;(4)3 mL置于25 mL容量瓶;(5)3 mL置于20 mL容量瓶;(6)5 mL置于25 mL容量瓶。分别加入70% EtOH稀释至刻度,摇匀即得。分别精密量取10 μL上述(1)～(6)溶液注入HPLC。以横坐标为进样量(v),纵坐标为峰面积(A),作线性回归(方程为y=37 659x-7 934.7,r=0.999 9)。分析试验结果,浓度在9.62～38.47 μg/mL之间,黄芩苷的进样量与峰面积具有良好的线性关系(如图5所示)。

图5 黄芩苷标准曲线

2.3.6 样品稳定性考察

取供试品溶液在0,1,2,4,6,8,10,12,18,24 h进样,黄芩苷峰面积(A)的RSD=0.3%,分析试验结果可以得出24 h内的供试品溶液具有良好的稳定性。

2.4 样品的测定

取三批供试品,根据表2中方法配制供试品溶液,精密量取10 μL的对照品溶液、供试品溶液分别注入HPLC→测定峰面积(A),含量用外标法计算。所得结果见表4。

表4 黄芩苷含量测定结果

3 讨论

3.1 比较含量测定方法

按照药典方法、本法分别测定黄芩苷的含量,所得结果见表5～6。

表5 药典方法测定结果

表6 本法测定结果

分析两种方法测定的黄芩苷含量基本一致,无显著性差异。

3.2 转移率的计算

3.1项下黄芩饮片和2.4项下柴归夏妇安煎煮茶中黄芩苷含量测定结果,得到的转移率结果见表7所示,试验结果符合要求。

表7 黄芩苷含量转移率测定结果

根据2020年版《中国药典》一部中黄芩饮片中黄芩苷的含量限度应≥8.0%和每袋柴归夏妇安煎煮茶含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计剂量应≥40.0 mg。流动相的选择参考诸多文献,对多种流动相进行了试验考察,最终根据R、n、tR等,综合考虑选择流动相为MeOH-0.3%H3PO4(体积比45∶55)。采用HPLC法对柴归夏妇安煎煮茶中的黄芩苷进行含量测定,方法快速、简便,所得结果可靠、有效、准确,因此可作为本中药制剂含量测定的方法使用。

4 结论

采用HPLC法测定柴归夏妇安煎煮茶中黄芩苷的含量,方法快速、简便,所得结果可靠、有效、准确,因此可作为本中药制剂含量测定的方法使用。