王世光,曾军杰

(浙江省海洋水产研究所,浙江海洋大学海洋与渔业研究所,浙江 舟山 316021)

1 研究背景

1.1 河豚鱼资源概况

河豚一般指硬骨鱼纲的鱼类,经常在长江口岸活动,江浙百姓都习惯称呼它为 “河豚鱼”。目前,已经发现的河豚鱼种类就已高达数百种之多,常见的河豚鱼也有几十种,而无毒的种类较少,仅为20种左右。在我国发现的河豚鱼有40多种,分8个属,从45°N到45°S都有分布,我国主要分布于长江下游一带和沿海地区[1-2],主要品种及毒力分布见表1。当河豚鱼发现异常状况时,通常体内会产生TTX来躲避敌人带来的威胁。河豚鱼的美味由来已久,然而食用者发生死亡的例子也时有发生[3],所以在中国,从1998年开始就已经禁止食用,甚至在东南亚的一些国家都颁布法令,禁止河豚鱼在市场上流通,我国民间也因此有了“拼死吃河豚”的说法。2016年以来,农业农村部逐渐开放河豚鱼养殖,辽宁、江苏、广东等共16家企业为养殖试验点,品种为红鳍东方鲀和暗纹东方鲀。

表1 我国常见河豚鱼品种、分布海域及各器官毒力情况

1.2 河豚毒素介绍

河豚毒素(Tetrodotoxin,简称TTX)是生物体内所含比较常见的生物碱。它是毒性极强的神经毒素,毒力约为氰化物的1 250倍。对于TTX的来源众说纷纭,既有认为TTX是外源性的,也有认为是内源性的,至今都没有一个准确定论[4-5]。

TTX相对分子质量为319.27[6],分子式C11H17N3O8。主要存在于卵巢、肝脏等部位中[7],含毒量以卵巢和肝脏最高,且性质稳定,普通烹饪手段较难破坏。常见的同系物[8]较多,主要为5-deoxyTTX、11-deoxy、4,9-anhydro TTX、5,11-dideoxy TTX、6,11-dideoxy TTX、5,6,11-trideoxy TTX、4,9-anhydro-5,6,11-trideoxy,见图1。TTX纯品为白色结晶体,在弱酸性溶液中溶解性极好,弱碱环境下会发生自然沉淀。TTX能以两性离子存在,在强酸强碱中均会遭到破坏,强碱可使其破坏为无毒化合物:2-氨基-8羟基-6羟甲基-喹唑啉。

图1 河豚毒素及其同系物的分子结构式(图片源于网络)

TTX 的分子量较小,结构特殊,易溶于弱酸性溶剂,在强酸和强碱的溶剂中结构易遭到破坏,在20世纪60年代初,国外学者[9-12]对TTX构造进行了深入的研究,经历了15年之久的研究,采用制备衍生物及进行X衍射实验方法等,终于发现TTX 笼形原酸酯类结构,结构中的碳原子全部为不对称取代,在游离状态下以3种形态相互平衡的混合物存在[13]。

1.3 河豚毒素应用进展

目前,我国渤海、黄海、东海海域一直延伸至南海海域,一共生活着形形色色的河豚鱼,共计40多种,一年捕捞量可达数万吨,效益高达几十亿。人们在追求无毒河豚鱼的同时,却遗忘了市场需求量更大的TTX,自从2016年河豚鱼养殖开禁,TTX一直呈现出一种供不应求的状态。据调查,每克TTX粗品市场价达8万元,纯度97%以上的TTX纯品价格为30万元。

TTX作为局麻药,其麻醉作用比一般的麻醉药效果强16万倍,TTX通过对动作电位的阻断来影响人们的生理活动甚至破坏神经[14-15]。研究发现[16]癌症病人的疼痛可以通过TTX的注射来进行缓解,效果甚至比临床常用的杜冷丁还好。TTX的作用不仅仅能减轻剧痛,对呼吸系统疾病的缓解,对甲肾上腺素的抑制,对心脑血管系统疾病的缓解都具有特别突出的疗效等[17-18]。在用于缓解癌症晚期的剧烈疼痛和戒毒时,患者不会上瘾,是化学药物和中草药的优良替代品。

2 研究现状

2.1 河豚毒素检测方法

2.1.1 小鼠生物检测法

20世纪40年代,Kao[19]开始进行小鼠生物检测法,当一定浓度的TTX被注射进入小鼠体内后,小鼠会呈现出死亡状态,并且死亡时间和TTX含量有一定的线性关系。起先表示TTX毒力的是鼠单位(MU)[20],在实验条件下,一只20 g的小鼠皮下注射0.2 mL TTX 溶液,10 min死亡的剂量为1个鼠单位。这种方法操作简单,不需特殊设备,但需要大量老鼠,且容易受小鼠个体差异影响,重复性较差。

2.1.2 酶联免疫检测法

20世纪80年代,酶联免疫法[21]测定TTX逐渐广泛应用,它是根据抗原与抗体的结合,以及氢键等键能影响衍生出来的一种分析方法。Matsumura[22]采用酶联免疫的方法对TTX进行了定性分析,由于酶联免疫法的灵敏度较高,能够确保这种特异性及定量关系,在筛选水产品中TTX的情况下,一次性可进行大批量实验,但酶联免疫存在着一定情况的假阳性。

2.1.3 理化检测法

2.1.3.1 荧光、紫外分光光度法

荧光法的检测原理是TTX在碱性环境下发生水解产生C9,TTX的含量是通过C9碱来定量的。这是最早建立起来的定量检测TTX的方法,曹爱英等[23]利用NaOH与TTX进行柱前衍生,TTX衍生物在最大激发波长为370 nm,最大发射波长为495 nm条件下具有荧光性。TTX在衍生产生C9的同时,副产物也伴随有同等质量的草酸钠产生,它在230 nm的波长下有明显的紫外光吸收,因此用紫外分光光度法也能对TTX定量检测。荧光、紫外分光光度法均能检测TTX,但灵敏度以及准确度与其他检测的方法相比还是有所欠缺。

2.1.3.2 薄层色谱法

薄层色谱法[24]是一种比较传统的鉴定手段,具有简单易行,易操作,分离效果好等特点,应用范围比较广泛。该法根据TTX极性比较大这一特性,将它与氢氧化钠进行反应,产生显色物质从而定性测量。点板常用的展开剂为正丁醇、乙酸、水体积比4∶1∶2,最低检出限为4.0×10-9mg/L,但是这种方法只能用于TTX的定性分析,应用并不广泛。

2.1.3.3 高效液相色谱(HPLC)法

HPLC-荧光检测器(FLD)、紫外检测器(UV)法是实验室中使用最为普遍的检测方法,主要通过不同的检测器对检测物质进行定量。在碱性条件下,将TTX进行衍生,产生的衍生物质具有可见光吸收信号,可以通过荧光检测器或紫外检测器进行检测。荧光衍生的反应机理:TTX分子上有1个pKa值很高、在水溶液中极易质子化、在碱性溶液中非常不稳定的胍基和1个在酸或碱中均易发生水解的原羧酸基。辛少平等[25]对TTX衍生化,优化了色谱条件,建立了新的检测方法,该方法检测限低,灵敏度高,重复性好。

蒸发光散射检测器(ELSD)是通用型检测器,TTX在经HPLC-ELSD检测时有明显的响应,主要由于TTX只有在紫外波长200 nm下才有较弱吸收峰,但在ELSD下有明显的折射光。王小逸等[26]联合使用HPLC-ELSD,对TTX进行纯化研究,以YWG-C18为色谱柱,发现ELSD检测灵敏度高、检测限低,同时还具有良好的线性,基线非常平稳,在检测分析方面有着良好的性能。

2.1.3.4 HPLC-MS/MS法

HPLC-MS/MS是近些年国内外研究热点,主要通过对目标离子进行轰炸,产生多个离子碎片,对响应最高的子离子再次碎裂,最终得到定性、定量离子片段,以此对目标物质进行分析。免疫亲和柱净化-HPLC-MS/MS是目前使用频率最高检测TTX的方法。免疫亲和柱是利用TTX与柱填料内小鼠腹水特异性识别的特点,TTX以小鼠腹水作为载体发生结合,随后去除基质,达到净化的效果。严忠雍[27]开发的免疫亲和柱净化-UPLC-MS/MS法,线性范围广、灵敏度高,检测限低至0.3 ng/mL,远远低于其他检测TTX的方法,此方法应用非常广泛。

2.1.3.5 GC-MS/MS法

随着质谱技术的发展,GC-MS/MS凭借超强的定性能力,已经成为最有效、最准确的检测分析方法之一。气相色谱-质谱法主要利用TTX水解产生的衍生物,经净化、衍生化后进行全扫描方式检测,定量离子392。吴平谷等[28]对该法进行了优化,选择的色谱柱为:HP-5MS 5%苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱,不分流进样,流速控制在110 mL/min。建立了比较完善的TTX前处理及气相色谱-质谱法检测体系,具有灵敏度高、重复性好等众多优点。

近年来,众多新兴技术逐渐进入大众的视线,仿生纳米酶因其具有结构简单、化学性质稳定的特点引起了广泛关注,张金艳等[29],通过基于氧化石墨烯修饰的金属网作为捕获探针,以及 AuPtRh 三金属纳米酶连接核酸适配体作为信号探针,开发出了一种SSM-GO/AuPtRh-aptamer传感器对河豚毒素进行捕获。

2.2 河豚毒素提取、纯化工艺现状

2.2.1 河豚毒素的提取

TTX主要用酸性水溶液或酸性甲醇溶液提取,陈成添等[30]采用热甲醇法、微火煮沸法、沸水浴法对河豚鱼混合卵和混合肝进行毒素提取,发现水浴提取效果较佳。黄枝梅等[31]则通过超声辅助提取替代了水浴提取TTX,大大地提高了对TTX提取的效率。

2.2.2 河豚毒素的分离技术

2.2.2.1 中性氧化铝柱层析法

中性氧化铝具有多孔疏松结构,能够进行物理吸附。较早就有报道,日本学者[32]用一系列方法提取粗品TTX溶液,而后,用氧化铝柱纯化制备,得到LD50为13 μg/kg的TTX,这也是最早的提纯TTX的方法。

2.2.2.2 活性炭柱层析法

活性炭是种吸附性能极强的非极性物质,无固定形状,因其孔径繁多而使表面积增大,这一特性使得在吸附物质时效果更好于其他吸附剂。当对TTX提取液进行吸附纯化时,大部分色素及组织能被活性炭保留,极性较大的TTX反而能够被洗脱下来,但不足的是TTX的毒力也会有一定的损失。根据这一原理,王智等[33]利用C18进行萃取,作为前处理的净化方法开发了UPLC-MS/MS法测定食品中的TTX,该方法回收率高、重复性好,精密度与准确度都能满足日常监测需求。

2.2.2.3 离子交换柱层析法

离子交换树脂柱层析法是现阶段使用比较广泛的一种提纯手段。TTX在弱酸性溶液中以铵盐C11H16O8N2NH2+存在,在溶液中与离子交换剂进行结合,因为各组分之间的亲和力不同而使TTX达到分离的目的。该法主要选择D152,D101等几种型号的离子交换树脂。黄枝梅等[34]对D152树脂吸附TTX进行了详细的报道,从吸附方式、样液pH值、洗脱工艺等几个方面深入探究了层析条件,该方法为TTX大规模化制备提供了坚实的理论基础。

2.2.2.4 凝胶柱层析法

凝胶柱层析法主要机理是分子筛效应,当TTX提取液用来柱层析纯化时,进入孔径较小凝胶柱后,较大分子的蛋白质,色素类物质因为被阻挡不能进入凝胶孔隙中,而较小的分子的TTX则能进入凝胶孔隙,加入一定量的洗脱剂,蛋白质类分子就随洗脱剂从凝胶间隙洗脱下来,受到的阻力越小,能够越快地从柱床馏出,TTX分子物质则从上一层凝胶孔隙中出来又扩散到下一层凝胶孔隙中,这样多次反复,大分子物质首先从层析柱床中馏出。Firoz Ahmed[35]采用Bio-gel公司的P2型号凝胶进行柱层析纯化,使TTX纯度提升至45%以上。

2.2.2.5 膜分离技术

膜分离技术主要根据分步截取不同分子量物质的原理进行纯化。易瑞灶等[36]主要通过微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜等多级膜分离技术制备高纯度TTX,通过此技术将TTX纯度提升至99%以上,并能进行规模化生产。

2.3 河豚毒素风险评估现状

TTX风险评估是对居民日常消费的水产品中TTX含量的一项调查研究。目前,对河豚毒素的风险评估调查较少,而其他水产品包括贝类、鱼、虾、蟹等品种的污染状况研究却不见报道。杨双喜等[37]对宁波市市售水产品TTX污染状况进行了调查,总体表现为相同品种的水产品,冬春季节毒力含量大;种类差异较大,检出的主要品种为贝类;阳性率高,但含毒毒力较低。

3 展望

河豚毒素最大的问题是价格较高,其作为Na+通道阻滞剂,独特的性质在医药方面发挥着巨大的作用,由于生物体内TTX含量较低,药企的原料供应面临着严峻的考验,导致价格一直居高不下,因此进一步的人工合成也成为了各位科学工作者的研究方向。而安全性是TTX药物的另一关键性问题,国外已经有相应的河豚毒素制剂问世,我国对TTX药物的研发尚且处于空白状态。科研人员对药物的研发包括毒理性、安全评价等重复性实验,临床上对安全剂量[38]进行层层把关。一旦以河豚毒素为原料相关药品惠及大众,医学界的许多疑难问题或将迎刃而解。