赵玉霞,孙青芝

(贵州警察学院 刑技系,贵州 贵阳 550005)

法医毒物学是在法医学背景下针对生物样品中药物和其他外来化合物及其代谢物的检测、鉴定的学科。法医毒物学分析的生物样品范围广泛,常规基质有血清、血浆、全血和尿液等,随着检测技术的发展,替代基质的分析样品也逐渐出现,典型的有唾液、头发、指甲、汗液和脑脊液等,与血液样本相比,唾液、头发和汗液样本更易收集。此外,头发和指甲等角化基质,由于其具有长期稳定性,目前也成为收集的对象[1]。法医毒物目标分析物主要有非法/受控物质及其代谢物、药物、酒精和毒物等。

样品制备是法医毒物分析中最关键的步骤,目的是消除样品基质的干扰、预富集目标分析物,并减少基质效应,提高检测灵敏度[2-3]。本课题组曾采用固相萃取——离子色谱法测定了血液中的草甘膦及其代谢产物氨甲基膦酸,该方法具有准确、灵敏的特点,可用于公安机关对血液中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的分析[4]。样品制备的方法有液-液萃取(Liquid liquid Extraction,LLE)、固相萃取(Solid phase extraction,SPE)和蛋白质沉淀。LLE和SPE通常要进行多步操作,需要大量高纯度有机溶剂,这些程序不仅耗时,而且易导致分析误差;蛋白质沉淀快速且简单,缺点是清洁度有限,易损害仪器,从而缩短色谱柱的寿命或在液相色谱-质谱联用(Liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS)中产生高基质效应[5]。在过去几十年,基于微萃取的新型样品制备技术已在不同领域应用[6-10],与常规方法相比,微萃取方法成本低、不污染环境。目前,微萃取方法在法医毒物学方面的应用仍然较少。

总结了过去10年法医毒物学绿色样品制备中用于分析替代生物样品的最新进展,并阐述了法医毒物学中用于样品制备的微萃取和微型萃取技术。

1 替代生物样品概述

目前,法医毒物分析中常见的替代生物样本分为两大类,死前替代生物样本:毛发、唾液或口腔液、指甲剪屑和指甲刮屑、汗液,以及母体生物样本,如羊水和母乳;死后替代生物样本:全指甲、玻璃体液、骨和骨髓、脑脊液等。

1.1 毛发

毛发样品的分析能反映药物成瘾史或药物毒性等信息[11]。在法医毒物学分析中,药物经血液循环进入毛发,毛发以恒定速度生长,那么毒物在毛发中的沉积取决于药物在血液中的浓度。研究表明,毛发中的毒物在特定条件下非常稳定,因而毛发分析可以提供更大时间跨度的信息[12]。毛发分析的一个重要步骤是去污,提取的毛发样品可能含有洗护用品、汗液或环境中的各种污染物,而这些污染物在分析过程中会产生干扰,进而影响结果。因此,需要将污染物从毛发表面除去,一般来说,用二氯甲烷或丙酮处理仅能去除毛发表面的污染物,而用甲醇会使毛发膨胀并将目标分析物溶于其中,从而改变药物浓度,所以,最好使用有机溶剂和水溶液进行去污处理,必要时还应保存洗发溶液[13]。

1.2 指甲

异源化合物可储存在指甲中,且随着指甲的生长,药物和酒精等异源化合物会进入指甲的角蛋白纤维并长时间停留[14]。与毛发相反,指甲不断生长,不会发生因去除指甲而导致无法进行药物检测的情况。死前指甲样本主要有两种,即指甲剪屑和指甲刮屑,整个指甲都可用于法医毒物分析。指甲剪屑是通过剪刀切割指甲过度悬垂进行收集的,而指甲刮屑则是用锋利的刀片磨损上指甲层进行收集的[15]。手指甲可反应近3～5个月的身体信息,而脚指甲因生长速度较慢时间可延长至8～14个月。关于指甲刮屑,由于其表面积较大,分析时更容易受到汗液或环境污染,因此,指甲刮屑中的药物浓度可能高于指甲本身。指甲样本在仪器分析前也需去污,可通过水、肥皂溶液、缓冲溶液和有机溶剂进行。但这些方法尚不能确定是否能提取其中的药物及对药物的提取程度[16]。

1.3 唾液

唾液是从头部和口腔的多个唾液腺分泌的液体,可通过咳痰或将吸收剂收集器放入口中进行收集的样品,内含血液、淋巴、裂隙液、牙龈、脸颊细胞及各种腺体的混合唾液。基于全唾液中的血清成分,唾液在法医毒物分析中作为一种替代生物样品而受到关注。首先,唾液和口腔液的收集简单且无创;其次,唾液为大量人群筛查提供了一种简便有效的方法;第三,与富含蛋白质和脂肪成分的生物样本相比,唾液样本制备更容易;最后,由于唾液腺状况和毒理学药物监测的指标,在法医生物学中是一种重要的鉴别元素[17-18]。

1.4 其他替代生物样本

其他替代生物样本主要有汗液[19]、羊水、母乳和胎粪等。母乳能反应药物用量、揭示母体与新生儿药物暴露等信息。其缺点是母乳中含高脂成分,在分析过程中可能会产生干扰,且收集不便、样本变异性大,会发生侵犯隐私等问题。羊水需要的样品制备最少,干扰相对较低,但取样过程中对人体有较高侵入性,可能伴随并发症[20]。新生儿体内的粪便可反应新生儿在妊娠期间的药物暴露信息,与尿液相比,胎粪分析可将药物使用的检测窗口延长至妊娠的最后20周左右[21-22]。

此外,用于死后法医毒物分析的替代基质还有:眼球玻璃体液[23-24]、胆汁[25-26]、胃内容物[27]、人体组织如肝脏和肾脏[28]、脑组织[29]、脑脊液[30]、牙齿及骨骼化遗骸[31-32]。

2 法医毒物分析中替代生物样品的绿色样品制备技术

2.1 固相微萃取

SPME是一种外部涂有适当固定相的熔融石英纤维的样品制备技术。涂层是由多个聚合物固定相组成的薄膜,通过吸收或吸附直接提取样品表面的有机物[33]。目前常用的纤维涂层有聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane ,PDMS)、聚二甲基矽氧烷/二苯(Poly-dimethylsiloxane/divenylbenzene,PDMS/DVB)、聚丙烯酸酯、碳氧烷/聚二甲基硅氧烷和稳定柔性二苯/碳氧烷/聚二甲基硅烷[34]。常用的提取目标分析物的SPME技术有两种:直接浸没固相微萃取(Direct immersion solid phase microextraction,DI-SPME)和顶空固相微萃取(Headspace solid phase microextraction,HS-SPME)。DI-SPME是将纤维直接浸入样品溶液中,HS-SPME是将纤维暴露在样品上方的气相中。SPME作为一种平衡技术,通过搅拌增加平衡速率,从而达到平衡所需的萃取时间,再将目标提取物通过加热或添加适当有机溶剂的方式加入气相色谱仪进行解吸[33]。

目前,SPME样品制备技术因具有简单、快速、溶剂干扰率低及灵敏度高等特点,已成功用于法医毒物学中多种目标分析物的测定,如麻醉品、安非他命、可卡因、大麻素、美沙酮和其他阿片类物质、作为酒精过量标志物的脂肪酸乙酯、苯二氮卓等[35]。表1总结了近十年来用于法医毒物分析中替代生物样品制备SPME样品制备技术。

表1 SPME在法医毒物学替代生物样品中的应用

Roessig等[36]开发了一种100 μm HS-SPME胎粪样品制备技术,用于气相色谱-质谱(Gas chromatography-mass spectrometry ,GC-MS)分析胎粪样品中的脂肪酸乙酯前的样品制备。由于脂肪酸乙酯作为胎粪和毛发样品中的生物标志物,可用于评估宫内长期乙醇积累,进而推断怀孕期间是否饮酒。因为,怀孕期间饮酒可能导致胎儿酒精谱系障碍,从而引起各种疾病症状。Silveira等[37]用同样的方法从母乳中成功提取大麻素。

Narapanyakul等[39]在GC-MS测定前,已通过HS-SPME从玻璃体液中提取甲基苯丙胺,并与死后血液、尿液中的甲基苯丙胺含量进行比较。研究发现,当常规样品不可用或受到污染时,玻璃体液可作为血液和尿液样品的重要替代品用于甲基苯丙胺的测定。

Inukai等[42]将在线管内SPME(On-line in-tube SPME,IT-SPME)方法用于提取毛发样品中的尼古丁和可替宁。在该方法中,目标分析物从毛细管内壁上的Carboxen 1006固定相中提取并转移至液相色谱柱,实现了HPLC-MS/MS提取、预浓缩和毛发样品分析的自动化能力。IT-SPME最初是由Eisert和Pawliszyn[43]组装的光纤SPME的自动替代品。管内SPME是一块内表面涂有固定相的开放管状熔融石英毛细管柱,在样品制备过程中,样品移向固定相,提取和浓缩目标分析物(通过吸附/吸收现象),再用合适的解吸溶剂洗脱。基于管内SPME的自动化能力,因此它能够连续分析样品。此外,管内SPME克服了传统SPME中纤维脆性、低吸附能力和厚膜涂层泌水的缺点,IT-SPME中使用了大量材料和涂层。合适的固定相取决于目标分析物及样品基质的性质。目前,常用的有壁涂层开管和多孔层开管GC柱。其中,多孔层开管GC柱因有较高的吸附表面和较厚的膜层,故而萃取效率较高。由于氢键、π-堆积和疏水相互作用,碳纳米管是有机化合物的常用吸附剂。当使用碳纳米管作为吸附剂时,分析物的吸附发生在其易于接近的壁上或间隙中[43]。

2.2 液相微萃取

LPME是常用的替代样品制备技术,可使用少量溶剂从水溶液中提取目标分析物,它克服了液-液萃取中消耗大量有机溶剂的限制和固相萃取中样品携带的限制。由于提取溶剂与样品接触方式不同,LPME主要分为单滴微萃取(Single-drop microextraction,SDME)、分散液-液微萃取(Dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)和中空纤维液相微萃取(Hollow fiber liquid-phase microextraction,HF-LPME),除此之外,研究人员还在不断开发和评估新的技术。HF-LMPE中含有提取溶剂的一次性丙烯多孔中空纤维,该纤维可有效减慢有机溶剂在本体溶液中的溶解,优点是成本低、样品净化效率高、可提供高富集因子[44]。HF-LPME有两种主要类型:即两相HF-LPME和三相HF-LFME。两相HF-LPME通常用于提取低极性的目标分析物,而三相HF-LPME通常用于提取可电离化合物(酸和碱)[45]。DLLME是LPME的另一种形式,用注射器将合适的溶剂混合物(提取溶剂和分散剂溶剂)快速注射到样品溶液中,由完全分散到水性样品中的提取溶剂的细液滴形成浑浊溶液,离心将提取溶剂富集在提取容器的底部,再进行目标物的提取和分析,优点是简单、快速、有机溶剂用量少、富集系数高,且提取溶剂和样品溶液之间表面积大,极大提高了提取效率[46]。表2总结了LPME在法医毒物分析中替代生物样品的LPME样品制备技术。

Pantaleao等[47]将三相HF-LPME技术用于从人毛发中提取苯丙胺类兴奋剂(即安非他命、甲基苯丙胺、芬普洛韦、3,4-亚甲基二氧甲基安非他胺及3,4-亚甲基二氧化亚丙胺)。具体操作:先在毛发样品中添加二氯甲烷去污,并用氢氧化钠对样品水解,后将水解样品置于Eppendorf管中并加入氯化钠,在中空纤维孔中填充二己基醚,纤维内腔中填充15 μL 0.1 mol/L盐酸(受体相),振荡,萃取45 min,从纤维中除去受体相并在氮蒸汽下干燥,再加入三氟乙酸酐和乙酸乙酯的混合物进行衍生化。最后,样品在氮气蒸汽下再次干燥,并在GC-MS分析之前进行乙酸乙酯中重构。结果表明,此方法有机溶剂用量少,检测限和定量限低。

Silveira等[48]将三项HF-LPME技术,用于GC-MS测定母乳中的可卡因及其衍生物。具体操作:先将母乳置于Eppendorf管中,加入氘化内标,pH值调至9.0,向溶液中加入氯化钠达到盐析效应,在填充有正辛醇的聚丙烯中空纤维孔中进行三相HF-LPME,纤维内腔填充0.4 mol/L盐酸溶液。在2 400 r/min的多管涡流下混合30 min,将受体相从纤维转移至小瓶,在氮气流下干燥,残留物用N,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷衍生,冷却至室温后,将1.0 μL的等分试样用GC-MS分析。与常规用于母乳预处理的萃取技术相比,LPME所需有机溶剂及样品量较低,是一种有效的替代样品预处理技术。

Dos等[49]在GC-MS分析前,用三项HF-LPME从玻璃体体液中提取抗抑郁药,如阿米替林、去甲替林、丙咪嗪和去丙咪嗪等。具体操作:先将样品转移至5 mL玻璃管中,加入氢氧化钠溶液及氘化内标物,在孔内填充十二烷聚丙烯的中空纤维中进行三项HF-LPME,纤维内腔填充0.1 mol/L甲酸为受体相,在1 000 r/min 55 ℃下搅拌,10 min内提取目标分析物,氮气流下干燥,再在甲醇中重构残留物。研究人员还评估了人和牛玻璃体体液与盐水溶液的基质效应,结果表明丙咪嗪和去甲咪嗪变异性较大,而阿米替林和去甲替林没有明显的基质效应。

2.3 其他绿色提取技术

除SPME和LPME外,其他绿色提取技术也可用于替代生物样品的样品制备。表3列举了其他绿色提取技术在法庭科学毒物分析中替代生物样品制备中的应用。

Ezoddin等[55]在基于悬浮有机液滴微萃取固化的基础上,用超声波辅助超分子技术(Ultrasonic assisted supramolecular based on solidification of floating organic drop microextraction,UA-SM-SFO-ME)从唾液样品中提取美沙酮。具体操作:用超声波辐射1-十二醇和四氢呋喃,形成含反胶束的超分子溶剂聚集体,将获得的超分子溶液分散在样品溶液中,在超声波作用下,2 min内提取目标分析物,离心使相分离,再将样品置于冰中,将超分子溶剂固化、去除、熔化并分析。研究结果显示超声波能量的使用能提高提取效率。

填充吸附剂微萃取技术(Microextraction by packed sorbent ,MEPS)在法医毒物分析中也用于替代生物样品的绿色样品制备,使用时将吸附剂材料直接填充到放置在注射器主体和针头之间的小药筒中。与传统SPE技术相比,MEPS具有操作简便、提取时间短、样品和溶剂消耗量少等优点[58]。Montesano等[59]在HPLC-MS/MS测定前,用MEPS技术制备样品同时分析口腔液中的20种非法药物,如可卡因、安非他明、天然和合成类阿片和迷幻剂。具体操作:将口腔液样品蛋白质沉淀,用含有C18吸附剂的注射器,通过分配和抽吸等分样品实现目标分析物的提取,洗涤吸附剂,在甲醇中加入5 mmol/L甲酸,再进行五个周期的分配和抽吸循环洗脱分析物,最后用HPLC-MS/MS分析。研究结果表明:此方法在提取目标分析物方面,具有良好的精密度和准确性,同时发现,MEPS吸附剂可重复利用至少100次。

磁性固相萃取(Magnetic solid-phase extraction,MSPE)是另一种小型化样品制备技术,也被用于法医毒物分析中替代生物样品的提取。MSPE是将磁性吸附剂直接加至含目标分析物的样品溶液中,吸附后,用外部磁场分离磁性吸附剂,去除水性样品,再添加适当的溶剂进行洗脱,最后通过磁分离技术进行相分离。MSPE具备d-SPE吸附剂与目标分析物接触面积大的优点,从而提高了提取效率。与传统SPE和LLE相比,MSPE是一种强大的样品制备技术,它减少了样品和有机溶剂的用量,被视为一种绿色样品制备技术[60]。Boojaria等[61]将硅烷修饰过的磁性纳米颗粒用于从人类毛发中提取吗啡。与常规SPE吸附剂相比,硅烷改性磁性纳米颗粒具有更大的表面积,因此具有吸附量大、灵敏度高、富集因子高及合成方法简单快速的特点。Esmaeili等[62]将超顺磁性Fe3O4@SiO2制备核壳复合纳米颗粒,用于混合半胶束固相萃取毛发中的苯二氮卓类,再用HPLC-DAD进行分析。本方法将十六烷基三甲基溴化铵作为表面改性剂,在二氧化硅上形成半胶束和混合胶束,进而增强了苯二氮卓类化合物的吸附,这种方法具有经济、简单、快速、提取效率高、有机溶剂用量少等优点。

3 结论

与法庭科学毒物分析中常用的传统基质相比,毛发、指甲、胎粪、组织、口腔液和唾液等替代生物样本的分析具有样品采集容易、稳定性高和时间跨度大等优点。各种新的萃取技术已被用于法庭科学毒物学中替代生物样品制备,SPME和LPME是最常用的样品制备技术,而SV-LPE、μ-SPE、MEPS和MSPE因具有减少有机溶剂用量、简单和快速等优点也是常用的绿色样品制备技术,目前,还有其他成熟的绿色样品制备技术如织物相吸附萃取(Fabric phase sorptive extraction ,FPSE)、胶囊相微萃取(Capsule phase microextraction,CPME)和固相萃取移液管尖端(Pipette-tip solid-phase extraction ,PT-SPE),由于其在样品处理方面的显著优势,最近也受到了极大关注。

目前,许多新型材料已成功用于从生物基质中提取有机物,如有机金属骨架、氧化石墨烯、碳基材料及分子印迹聚合物材料。这些材料以不同形式应用在样品制备技术中,如作为SPME纤维或搅拌棒吸附萃取的涂层直接用分散固相萃取,作为MSPE磁性纳米颗粒功能化后的磁性吸附剂,作为填充到移液管尖端后的PT-SPE吸附剂等。最后,结合多种绿色样品制备技术对离子液体和深共晶溶剂评估也可用于替代生物样品的制备。