李茂宸,范 颖,李洪洲,毕东雨,林庶茹,刘 倩

(1.辽宁中医药大学中医学院,辽宁 沈阳 110847;2.通用技术辽油宝石花医院中医科,辽宁 盘锦 124010)

近年来,以糖尿病为基础的心血管疾病的发病率显著增加,合并症中冠心病最为多见,而动脉粥样硬化是引起糖尿病患者心血管病变的主要原因［1-2］。课题组前期研究［3-4］显示,黄芪葛根汤具有降糖、降脂作用。研究［5-6］结果发现,远志汤中远志与石菖蒲均具有降血脂、保护心血管的药理作用。《圣济总录》中记载远志汤可用于治疗久心痛。研究［7-8］表明,内皮细胞间质化(endothelial-mesenchymal transition,EMT)是动脉粥样硬化斑块形成的主要原因,转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)/Smad是调节EMT的主要通路之一。本实验将黄芪葛根汤与远志汤合用,观察黄芪葛根汤与远志汤合方对糖尿病动脉粥样硬化大鼠糖脂代谢的调节作用,探究其延缓糖尿病动脉粥样硬化的作用是否通过TGF-β/Smad通路调节EMT而实现。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠70只,体质量(200±20)g,购自辽宁省长生生物技术有限公司［生产许可证号: SCXK(辽)2020-0001］,饲养于辽宁中医药大学动物实验室［实验室动物使用许可证号: SYXK(辽)2019-0004］,室温(24±2)℃,湿度50%～70%,自由摄食、饮水。本实验已通过辽宁中医药大学动物伦理委员会批准,实验动物伦理审查编号为210000420210667。

1.2 药物 黄芪(批号 28121025,产自内蒙古)、葛根(批号 31921007,产自安徽)、远志(批号 13621006,产自陕西)、石菖蒲(批号 06121007,产自安徽)均一次性从河北仁心药业有限公司购买。糖脉康颗粒(国药准字 Z10970026,由黄芪、生地黄、赤芍、葛根、桑叶、淫羊藿组成):四川宝鉴堂药业有限公司。

2 方法

2.1 模型复制 参照文献［9］结合预实验结果复制糖尿病动脉粥样硬化模型。第一步:采用高脂饲料饲养大鼠28 d;第二步:维持高脂饮食,第29天按30 mg/kg剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素(浓度2%,采用pH 4.2的柠檬酸钠缓冲液配制),复制高糖高脂模型。在注射链脲佐菌素第3天,测定随机血糖值≥16.8 mmol/L表明模型复制成功。

2.2 黄芪葛根汤与远志汤合方制备 查阅文献,依据药物的临床用量制备合方1(黄芪、远志、石菖蒲各10 g,葛根5 g);依据《证治汇补》《圣济总录》记载的用量制备合方2(黄芪、远志、石菖蒲各30 g,葛根15 g)。将中药饮片共同浸泡40 min,分别加10、8、6倍水,分别煎煮2.5、2.0、1.5 h,将3次药液混合,浓缩至合方1组和合方2组含生药量分别为0.315、0.945 g/mL,4 ℃冰箱存放备用。

2.3 动物分组及给药 将70只SPF级SD大鼠按随机血糖分为空白对照组、模型组、阳性对照组、黄芪葛根汤与远志汤合方1组(简称“合方1组”)、黄芪葛根汤与远志汤合方2组(简称“合方2组”)。空白对照组大鼠10只,其余各组大鼠15只。空白对照组采用普通饲料喂养,其他组采用高脂饲料喂养。模型复制成功当日开始连续灌胃给药49 d。阳性对照组灌胃糖脉康颗粒溶液［10.5 g/(kg·d)］,合方1组、合方2组的给药剂量分别为3.15、9.45 g/(kg·d),给药剂量均相当于60 kg成人临床用量的6.3倍,空白对照组、模型组灌胃等容积生理盐水,给药第50天,向大鼠腹腔注射20%乌拉坦(1.2g/kg)麻醉后采集标本。实验过程中,模型组死亡2只,模型未复制成功2只;阳性对照组死亡2只,模型未复制成功3只;合方1组死亡3只,模型未复制成功4只;合方2组死亡3只,模型未复制成功4只。大鼠死亡原因可能与药物剂量相关。

2.4 指标检测

2.4.1 血糖血脂水平检测 灌胃后每周定时采用血糖仪检测大鼠血糖。采集标本前12 h禁食,正常饮水,20%乌拉坦(1.2 g/kg)溶液腹腔注射麻醉后采集大鼠腹主动脉血,检测TG、TC、HDL-C、LDL-C、糖化血红蛋白A1c(glycosylated hemoglobin A1c,HbA1c)水平。

2.4.2 HE染色法观察主动脉的组织形态 取大鼠主动脉,常规HE染色后显微镜下观察主动脉形态并拍照。

2.4.3 RT-PCR法检测大鼠主动脉Vimentin、葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter-4,Glut-4)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1c)mRNA表达水平 先提取总RNA,再逆转录成cDNA。按照试剂盒说明书配置RT反应液(42 ℃ 2 min,37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,重复40个循环)和PCR反应液(95 ℃ 3 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 1 min,重复40个循环)。采用2-ΔΔCT法计算各组Vimentin、Glut-4、AMPK、SREBP-1c mRNA相对表达水平。qRT-PCR引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2.4.4 酶联免疫吸附试验检测大鼠血清Vimentin、Twist1、TGF-β、Snail1水平 严格按照酶联免疫吸附试验试剂盒说明书检测大鼠血清Vimentin、Twist1、TGF-β、Snail1水平。

2.4.5 Western blot法检测大鼠肝脏SREBP-1c和主动脉Smad-2、Smad-3蛋白表达水平 取肝脏和主动脉组织各0.1 g于EP管中,加入1 mL裂解液,研磨后静置30 min,在12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min,取上清。严格按照BCA试剂盒说明书对蛋白进行定量分析,应用Image J软件(1.8.0.112)进行分析。

3 结果

3.1 5组大鼠血糖水平比较 模型复制前与高脂饮食28 d后,各组大鼠血糖水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。给药第50天,与空白对照组比较,模型组大鼠血糖明显升高(P<0.05);与模型组比较,合方1组与合方2组大鼠血糖均显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠血糖水平比较

3.2 5组大鼠主动脉组织形态比较 空白对照组大鼠主动脉壁结构清晰,内皮细胞完整。模型组大鼠主动脉结构紊乱,内膜增厚,可见粥样斑块形成。合方1组与阳性对照组大鼠主动脉结构紊乱,部分区域可见内皮细胞破坏及粥样斑块形成。合方2组部分区域可见粥样斑块。见图1。

注:A.空白对照组;B.模型组;C.阳性对照组;D.合方1组;E.合方2组

3.3 5组大鼠血清HbA1c和血脂水平比较 与空白对照组比较,模型组大鼠血清TG、TC、LDL-C、HbA1c水平显著升高,HDL-C水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,合方1组与合方2组大鼠血清TG、TC、LDL-C、HbA1c水平显著降低(P<0.05),HDL-C水平显著升高(P<0.05)。合方1组与合方2组大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05),合方2组血清HbA1c水平显著低于合方1组(P<0.05)。见表3。

表3 5组大鼠血清HbA1c、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比较

3.4 5组大鼠主动脉Vimentin、Glut-4、AMPK、SREBP-1c mRNA表达水平比较 与空白对照组比较,模型组大鼠主动脉Vimentin、SREBP-1c mRNA表达水平显著升高(P<0.05),Glut-4、AMPK mRNA表达水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,合方1组与合方2组大鼠主动脉Vimentin、SREBP-1c mRNA表达水平显著降低(P<0.05),Glut-4、AMPK mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与合方1组比较,合方2组大鼠主动脉Vimentin、SREBP-1c mRNA表达水平显著降低(P<0.05),AMPK mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。见表4。

表4 5组大鼠主动脉Vimentin、Glut-4、AMPK、SREBP-1c mRNA表达水平比较

3.5 5组大鼠血清Vimentin、TGF-β、Twist1、Snail1表达水平比较 与空白对照组比较,模型组大鼠血清Vimentin、TGF-β、Twist1、Snail表达水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,合方2组大鼠血清Vimentin、TGF-β、Twist1、Snail1水平显著降低(P<0.05),合方1组仅Snail1水平显著降低(P<0.05)。与合方1组比较,合方2组大鼠血清Vimentin、TGF-β、Twist1、Snail1表达水平均显著降低(P<0.05)。见表5。

表5 5组大鼠血清Vimentin、TGF-β、Twist1、Snail1水平比较

3.6 5组大鼠主动脉Smad-2、Smad-3和肝脏SREBP-1c表达水平比较 与空白对照组比较,模型组大鼠主动脉Smad-2、Smad-3和肝脏SREBP-1c表达水平均显著升高(P<0.05);与模型组比较,合方1组与合方2组大鼠主动脉Smad-2、Smad-3和肝脏SREBP-1c表达水平均显著降低(P<0.05)。见图2、表6。

注:A.空白对照组;B.模型组;C.阳性对照组;D.合方2组;E.合方1组

表6 5组大鼠主动脉Smad-2、Smad-3和肝脏SREBP-1c表达水平比较

4 讨论

糖尿病是导致心血管疾病的主要原因之一,现代研究［10-11］证实,糖脂代谢异常可导致血管内皮细胞功能损伤。因此,通过调节糖脂代谢,保护内皮细胞,抑制EMT,可以有效控制糖尿病动脉粥样硬化。

现代药理学研究表明,黄芪、葛根具有降糖、降脂作用,远志具有抗炎、保护心脑血管的作用［12］,石菖蒲具有保护心血管的作用［13］。研究［14］证实,黄芪葛根汤可以调控TGF-β/Smad通路。《圣济总录》记载,远志汤可用于治疗久心痛。黄芪葛根汤和远志汤合用,可用于治疗糖尿病心血管病变。

研究［15］表明,动脉粥样硬化性病变是2型糖尿病患者发生心血管病变的病理生理基础。EMT是内皮细胞在高脂、高糖等因素作用下向间充质细胞转化的特殊状态,高脂、高糖状态下,内皮细胞的物理屏障和维持血管状态的功能均受到损害,加速动脉粥样硬化斑块形成,是导致糖尿病动脉粥样硬化的主要原因［3-4］。高糖环境会导致TGF-β/Smad通路的激活。TGF-β通过调节Smad2/3/4向细胞核内转移激活Snail、SIP1、Twist1等转录因子［16-17］,从而调节EMT。Vimentin蛋白是EMT的典型标志物,也受到EMT转录因子的反向调节,可反映EMT的情况。TGF-β/Smad通路下游的Smad2、Smad3能够调节转录因子Snail、Twist1基因表达。Twist1、Snail1是细胞核中与EMT密切相关的重要转录因子［16-17］,作为TGF-β/Smad通路的下游因子,Twist1、Snail1是调节EMT的重要靶点,与糖尿病动脉粥样硬化密切相关。脂类代谢异常可导致动脉粥样硬化中内皮细胞损伤［18］。SREBP-1c是调节脂肪酸合成酶活性的关键转录因子,SREBP-1c表达失调与血脂异常和2型糖尿病的发生关系密切［19］,可影响LDL-C与HDL-C的生成与代谢,二者不仅影响动脉粥样硬化斑块的形成,还影响EMT的进程［20-21］。AMPK磷酸化可间接抑制SREBP-1c表达［22］。黄芪葛根汤与远志汤合方通过抑制AMPK和SREBP-1c表达,进而调节糖脂代谢,降低体内血糖、血脂水平,保护血管内皮细胞,从而起到降糖、降脂,延缓动脉粥样硬化的重要作用。

本实验结果显示,血糖、血脂升高与EMT密切相关,黄芪葛根汤与远志汤合方一方面通过TGF-β/Smad通路直接调控EMT,另一方面可以通过调控糖脂代谢达到抑制EMT的作用。其作用机制是黄芪葛根汤与远志汤合方通过干预TGF-β/Smad信号通路,抑制Vimentin、Snail、Twist1、Smad3的表达,延缓EMT的进程;通过TGF-β上调HDL-C、Glut-4、AMPK蛋白表达水平,下调TG、TC、LDL-C、SREBP-1c蛋白及mRNA表达水平,调节糖脂代谢,抑制EMT。黄芪葛根汤与远志汤合方从上述两方面抑制EMT的发生,降低动脉粥样硬化发生的风险。本研究对黄芪葛根汤与远志汤合方调控糖尿病动脉粥样硬化的部分机制进行了解析,合方是否通过其他通路作用于EMT,以及黄芪葛根汤与远志汤合方独立作用的机制是否相同,尚需进一步研究。