董海城 许榕榕 王雯菲 张瑶 朱世峰

肥胖病是全球最常见的流行病之一,是心脑血管疾病、2型糖尿病等的危险因素[1,2]。针刺治疗肥胖疗效肯定,其确切机制目前尚不明确。近年来较多研究表明肥胖与线粒体功能受损关系密切[3,4],线粒体作为能量代谢的重要场所,其数量和功能的“质量控制”能维持健康的线粒体内稳态,线粒体内稳态的失衡在肥胖发生发展的过程中起重要作用。而腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)作为能量感受器,对线粒体内稳态的各个方面具有特定的调节作用,已成为防治肥胖、糖尿病等代谢性疾病的重要靶点[5,6]。本文拟从AMPK、线粒体内稳态的角度阐释两者之间的相关性,并初步探讨针刺干预肥胖的潜在机制,为后续的相关研究提供理论指导。见图1。

图1 AMPK调节线粒体内稳态示意图

1 线粒体与肥胖

肥胖发生的根本原因是能量摄入大于消耗,线粒体有“能量工厂”之称,是细胞能量产生的关键。肥胖及相关疾病发生的早期事件是各组织中线粒体密度减少和氧化代谢减少。研究表明,高脂喂养大鼠脂肪滴堆积,线粒体受损、肿胀或融合,纤维排序紊乱或纤维结构异常[7]。

线粒体是细胞进行三羧酸循环和氧化磷酸化(OXPHOS)的场所,能氧化三大营养物质生成为细胞生命活动提供能量的三磷酸腺苷(ATP),是细胞进行有氧呼吸的主要场所,也是细胞内活性氧簇(ROS)的最主要来源。大多数线粒体蛋白质由核基因(nDNA)编码,而极小部分由线粒体基因(mtDNA)编码,mtDNA缺乏nDNA中核小体的保护,也没有一个DNA修复机制,容易导致mtDNA的损伤和消耗[8,9]。肥胖的动物模型和人类脂肪组织中mtDNA拷贝数及蛋白表达均减少。mtDNA损伤的量化以及mtDNA拷贝数的分析和量化可能是肥胖及相关疾病进展和预后的生物标志物[10]。

线粒体主要分布在能量需求大的组织,如骨骼肌、心脏、肝脏等,人体骨骼肌中线粒体的含量随着运动而增加并在停止训练期间减少,骨骼肌缺失引起少肌型肥胖[11]。棕色脂肪组织(BAT)也含有大量线粒体,其特异性解偶联作用,使脂肪酸分解产生的能量的转化为热能,起到减肥的作用。总之,骨骼肌与BAT中线粒体的数量与超重、肥胖呈负相关[12]。

线粒体是高度动态运行的细胞器,经历不断的线粒体融合和裂变、线粒体生物合成和线粒体自噬,协调控制线粒体的形态、数量、质量、周转和遗传,能维持健康的线粒体内稳态,维持稳定的ATP产出。肥胖是一种慢性营养障碍性疾病,而营养状态的改变可以双向调节线粒体的形态和功能[13],肥胖状态下线粒体内稳态失衡。

2 AMPK与肥胖

AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,结构上由α、β和γ这3个亚基组成,用作细胞能量感受器,可以促进骨骼肌葡萄糖摄取和脂肪酸氧化,减少肝糖原合成,抑制脂肪酸和蛋白合成。ATP作为能量来源,相继被分解为二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)。当体内能量缺乏时,如低氧、缺血及OXPHOS受抑制时,伴随着AMP/ATP、ADP/ATP比值的升高,AMPK被磷酸化和激活,从而激活ATP再生途径,同时抑制ATP消耗途径。

肥胖是慢性能量失衡引起的,肥胖与AMPK之间呈负相关,AMPK活性降低与重度肥胖个体的内脏脂肪组织炎症和全身胰岛素抵抗增加有关[14]。多项研究表明,肥胖大鼠肝脏、肾脏、骨骼肌和脂肪等外周组织中AMPK磷酸化水平下降[15-18],而AMPK激动剂AICAR处理肥胖大鼠可以促进脂肪酸氧化,增加能量的消耗,降低大鼠体质量[19]。

药物二甲双胍除了降糖还能减轻体重,主要通过激活AMPK[20]发挥作用。许多AMPK活化疗法,在肥胖及糖尿病等代谢疾病中具有巨大的治疗潜力。研究表明,电针高脂喂养大鼠后骨骼肌AMPK蛋白表达水平升高[7]。糖尿病心肌病小鼠经电针干预后AMPK磷酸化水平显著升高,并降低血糖[21]。电针还能通过增强AMPK表达,改善大鼠缺血性脑中风、失眠及慢性疲劳综合征等[22-24]。针刺通过激活AMPK,如何调节线粒体内稳态,达到减肥目的是本文探讨的方向。

3 基于线粒体内稳态探讨针刺调控AMPK表达治疗肥胖的机制

3.1 线粒体生物合成 线粒体生物合成能产生更多新的线粒体,提高ATP水平,增加能量消耗,改善肥胖。有研究表明,肥胖机体的线粒体生物合成处于降低的状态[25,26]。运动和肌肉活动会诱导线粒体生物合成,运动也是AMPK的有效激活剂,提示AMPK可能参与了线粒体生物合成。研究证明,慢性AMPK激活导致线粒体生物合成增加[27]。此外,在小鼠中过度表达的构成型活性AMPKγ3亚基突变会诱导线粒体生物合成[28];而AMPKα亚基敲除和AMPK显性失活的小鼠均呈现线粒体生物合成和功能的缺陷[29,30]。总之,AMPK为线粒体生物合成的主要调节因子之一。

AMPK可直接调节过氧化物酶体增值物激活受体γ辅助活化因子-1α(PGC-1α)的功能促进线粒体生物合成:AMPK可直接磷酸化PGC-1α蛋白的Thr177和Ser538残基[31],能激活不同的转录因子如核呼吸因子(NRFS)1和2,及雌激素相关受体-α(ERR-α),促进线粒体转录因子A(TFAM)的表达,驱动mtDNA的转录和复制[32-34];同时,NRFS诱导参与OXPHOS的基因转录,并将细胞核编码的蛋白质转移到线粒体[35,36],从而促进线粒体生物合成[27,37,38]。

有研究表明,在癌细胞中,PGC-1α、NRF1和TFAM表达增加的同时线粒体数量却在减少[39,40],TFAM水平的提高和mtDNA拷贝数、mtDNA编码多肽的表达不一定呈正相关[41]。故线粒体生物合成发生的标志是mtDNA拷贝数、mtDNA/nDNA的比值升高及mtDNA表达水平升高[41]。

汤倩倩[42]通过电针提高肥胖大鼠腹股沟白色脂肪组织(WAT)中AMPK磷酸化的蛋白水平,上调PGC-1α-TFAM-UCP1通路的表达,降低大鼠体质量可能与促进WAT线粒体生物合成有关,但该实验未进行mtDNA拷贝数、nDNA拷贝数的测量。笔者认为,在线粒体生物合成方面,今后研究探讨方向为:针刺提高肥胖大鼠AMPK表达水平,激活下游因子PGC-1α及相关通路,能否促进mtDNA拷贝数、mtDNA/nDNA的比值升高及mtDNA表达水平升高,而AMPK基因敲除后,针刺是否还能激活下游因子促进线粒体合成。

3.2 线粒体自噬 线粒体自噬是一种选择性清除线粒体的模式[43],主要负责消除受损的线粒体,受损线粒体被隔离在双膜囊泡中,形成称为自噬体的双膜结构,自噬体与溶酶体融合形成自溶酶体,其中自噬体的内容物将发生水解降解[44]。在低氧条件下,线粒体的OXPHOS功能受到抑制,导致线粒体产生更多的ROS,对mtDNA、线粒体脂质和蛋白造成氧化损伤,而线粒体自噬能通过特异性降解受损的线粒体来防止进一步的损伤,保护细胞存活。

AMPK对线粒体自噬的调节主要通过丝氨酸/苏氨酸激酶Atg1和Unc-51样激酶1(ULK1)发挥作用,ULK1是酵母Atg1的同源物。其中,AMPK-ULK1轴对线粒体自噬很重要[45],AMPK通过ULK1在几个主要位点(包括Ser555[46]、Ser317和Ser777)的磷酸化直接激活自噬和线粒体自噬,AMPK或ULK1的缺乏会导致自噬接头p62的异常积累和线粒体自噬缺陷[46],而ULK1的突变体不能被AMPK磷酸化,则细胞表达出更多的受损线粒体。

有研究表明,经针刺干预脑出血大鼠后脑内结构损伤较少,自噬泡多于模型组,而针刺干预前经自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理后,线粒体自噬蛋白水平降低,并逆转针刺疗法对神经功能缺损改善的情况,提示针刺可通过增强线粒体自噬来减轻脑出血后的神经损伤[47-49],Zhou等[50]可视化和定量测量自噬活性结果表明大鼠衰老模型自噬能力下降,经穴位埋线和自噬促进剂干预后自噬能力下降趋势缓和,但这种影响被3-MA处理消除,提示穴位埋线有介导线粒体自噬作用。董佳梓[51]发现针刺足三里可能是通过AMPK/ULK1信号通路,有效地提高大鼠骨骼肌线粒体自噬水平,维持大鼠骨骼肌细胞内环境的稳态。

线粒体自噬与针刺治疗脑病是目前主流的研究热点,现国内外鲜见针刺调节线粒体自噬与肥胖关系的研究,且针刺能增强线粒体自噬是否与AMPK/ULK1信号通路有关,有待进一步证明。

3.3 线粒体融合、裂变 线粒体是不断融合和裂变的动态细胞器[52],共同平衡控制着线粒体的形状、数量和大小,对于线粒体功能和遗传很重要[53]。2个受损线粒体相遇后经历融合、分裂产生电位不均匀的子线粒体,具有更健康膜电位的子线粒体将继续参与线粒体网的融合和裂变循环,但去极化的子线粒体不再执行功能,常通过线粒体自噬降解。

在分子水平上,线粒体融合和裂变由关键的线粒体膜蛋白调节。线粒体外膜融合由MFN1/2介导[54],线粒体内膜融合由视神经萎缩1(Opa1)介导[55]。介导线粒体分裂的是一种大型GTP酶(Drp1),通过一组受体蛋白(MFF、Fis1、MiD49和MiD50)被募集到线粒体外膜参与线粒体裂变。

研究表明,在没有线粒体损伤的情况下,通过直接小分子激活剂激活AMPK足以诱导线粒体裂变[56]。Toyama等[56]发现MFF上两个磷酸化位点Ser155和Ser173是AMPK的新底物,活化的AMPK可以诱导MFF以促进Drp1从胞质溶胶募集到线粒体表面并参与线粒体裂变过程。而分子水平上关于AMPK与线粒体融合的研究较少,有研究表明虫草素能激活AMPK同时也能上调糖尿病小鼠Mfn2相对mRNA及蛋白表达[57],AMPK可能是Mfn2的上游调节剂[58]。

肥胖人群组织以线粒体裂变为主,线粒体融合受到抑制。肥胖人群或小鼠2型糖尿病模型的肌肉中线粒体尺寸减小,并伴有Mfn2的表达减少[59],同样,营养过剩会诱导胰腺β细胞中的线粒体断裂,是由线粒体融合的抑制介导的[60]。研究发现Mfn1可以在高脂饮食刺激下保护线粒体呼吸功能[61],Mfn2也会通过AMPK途径上调葡萄糖转运蛋白表达[62],Mfn1和Mfn2均能改善胰岛素抵抗,且骨骼肌中Mfn2的缺失会导致促糖尿病作用[63],提示促进线粒体融合疗法可能降低体质量,改善胰岛素抵抗。张婧怡[64]通过电针胰岛素抵抗大鼠穴位改善了大鼠线粒体结构,骨骼肌Drp1、Fis1蛋白表达得到抑制,Mfn1、Mfn2表达等得到保护性维持,证明电针对胰岛素抵抗大鼠具有抑制线粒体分裂、促进线粒体融合的作用。

根据目前的研究,AMPK激活能诱导线粒体裂变,对于改善肥胖似无益处。是否能在MFN1/2、Opa1上发现AMPK新底物,针刺激活AMPK后最终达到促进线粒体融合、抑制线粒体裂变的作用而缓解肥胖及相关并发症是一个新的研究方向。

4 讨论

中医学对肥胖的认识始于《黄帝内经·灵枢·卫气失常》:“人有肥、有膏、有肉…腘肉坚,皮满者,肥。腘肉不坚,皮缓者,膏。皮肉不相离者,肉。……膏者,多气而皮纵缓,故能纵腹垂腴。肉者,身体容大。脂者,其身收小……”将肥胖分为“脂人、膏人、肉人”,脂人肥大却身形较小,似“均一性肥胖”;膏人肥肉多而松软下垂,似“中心性肥胖”,肉人身体宽大,骨骼肌肉壮实,似“壮实之人”。

朱丹溪《丹溪治法心要》提出“肥白人多痰湿”、“肥白之人,沉困怠惰是气虚”,刘河间云:“肥人腠理致密,而多郁滞,气血难以通利”,提示肥人多痰湿和少气,病程日久,气虚血瘀或痰湿瘀互结是病理发展的必然结果。针刺减肥有辨证取穴,达到平衡阴阳、调理脏腑、运行气血及疏通经络的作用,相对于药物和手术疗法,安全有效、不易反弹[65],在临床上已被广泛应用。针刺减肥的主流方式主要有普通毫针针刺、电针和穴位埋线。穴位埋线是根据针灸学理论,通过针具将外科可吸收缝线埋在穴位内产生针刺效应来发挥作用,相对于普通针刺有作用持久、患者依从性好的优点。

在肥胖条件下线粒体内稳态平衡被打破,线粒体不仅形态变小,而且线粒体的合成、自噬及融合能力均受到抑制[66],ROS产生增加,导致新线粒体合成减少,衰老、损伤线粒体增加。目前研究表明,针刺能有效激活AMPK,并间接通过PGC-1α依赖性转录刺激线粒体生物合成―增加线粒体数量,促进ATP合成,增加能量消耗;又通过ULK1依赖性刺激线粒体自噬触发受损线粒体的急性破坏―控制线粒体质量,维持健康线粒体数量,稳定ATP产能,防止肥胖进展;还可能提高Mfn1/2蛋白表达水平促进线粒体融合―调节线粒体网络形状,保护线粒体呼吸功能,这些都说明针刺干预AMPK调节线粒体内稳态发挥减肥作用。

笔者认为,针刺能提高肥胖大鼠AMPK表达水平,潜在减肥机制研究方向建议如下:(1)激活下游因子PGC-1α及相关通路,促进mtDNA拷贝数、mtDNA/nDNA的比值升高及mtDNA表达水平升高,以促进线粒体生物合成;(2)是否通过AMPK/ULK1信号通路提高线粒体自噬水平;(3)磷酸化MFN1/2或Opa1上的AMPK新底物,促进线粒体融合。因此,深入探究AMPK和线粒体内稳态的相互作用将有利于进一步阐释针刺减肥的作用机制,丰富中医药理论。