李慧 张吴霞 熊烨

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种全身性、异质性的血液系统恶性肿瘤,是成年人中最常见且致死率较高的急性白血病[1]。未成熟的髓细胞在骨髓和外周血中积累和扩增,导致造血功能异常,是AML的病理基础[2]。AML的常规治疗是诱导化疗,但其治疗效果并不理想,生存率并未显著增加[3]。欧前胡素(imperatorin,IMP)是一种呋喃香豆素化合物,为中药蛇床子、白芷、羌活的有效成分,具有抗肿瘤、抗炎症、抗菌以及神经保护等重要作用[4]。例如,IMP可通过调节HMGB2抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移[5];还可通过下调mTOR/p70S6K/4E-BP1和MAPK通路抑制人结肠癌细胞增殖和血管生成[6]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在多种类型的癌症发展中起关键作用,包括细胞外信号调节激酶(ERK)为该蛋白激酶家族重要成员[7]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种细胞内信号通路,参与癌细胞生长过程中所需的各种代谢过程,p70核糖体S6蛋白激酶(p70S6K)是mTOR磷酸化的主要效应物[8]。有研究已经证明MAPK是mTOR/p70S6K通路的上游,且抑制MAPK/mTOR/p70S6K和Akt信号通路可抑制人胃癌细胞的生长[9]。本实验旨在基于MAPK/mTOR/p70S6K通路,探讨欧前胡素对AML细胞的影响以及其中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人AML细胞HL-60(美国ATCC公司);欧前胡素(货号:N0048,四川恒诚致远生物科技有限公司);PD98059、Cearoin(货号:HY-12028、HY-N8418,美国Med Chem Express公司)。

1.2 试剂与仪器 MTT细胞增殖检测试剂盒(货号:R20228,上海源叶生物科技有限公司);Annexin V-FITC/PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒(货号:E-CK-A211,武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司);肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)ELISA检测试剂盒(货号:EK-H12145、EK-H10327、EK-H10352,上海酶研生物科技有限公司);ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ一抗(货号:ab184699、ab278538、ab32028、ab109268、ab184551、ab2571、ab32124、ab207612、ab128025,英国Abcam公司);羊抗兔IgG H&L(货号:ab6795,英国Abcam公司);流式细胞仪(型号:BD LSR II,美国BD公司);iBright凝胶成像仪(型号:CL750,赛默飞世尔科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养:将人AML细胞HL-60用含有10%胎牛血清和1%双抗(青霉素和链霉素)的1640培养基培养,并置于37℃、5% CO2的培养箱中,每3天按照1∶3 传代,传至第3代用于后续实验。

1.3.2 MTT法检测IMP对HL-60细胞的毒性:将HL-60细胞以5×103个/孔接种至96孔板,培养24 h后,加入不同浓度的IMP(0、10、50、100、150、200、250 μmol/L)处理细胞24 h,并设置未用IMP处理的对照组作为阴性对照,然后在每孔加入10 μl MTT培养4 h。弃上清,每孔加100 μl的二甲亚砜(DMSO)混匀。用酶标仪测量每孔在490 nm处的吸光值。并计算细胞的存活率以及半数抑制浓度(IC50)。

1.3.3 细胞分组:将HL-60细胞分为对照组,ERK抑制剂组(PD98059组),IMP低、中、高剂量组,IMP高剂量+ERK激活剂组(IMP高+Cearoin组),每组均设置6个重复。对照组用正常培养基培养(PD98059终浓度为0 μmol/L),PD98059组用PD98059终浓度为10 μmol/L[9]的培养基培养,IMP低、中、高剂量组分别用含终浓度为50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L IMP[6]的培养基培养,IMP高+Cearoin组用终浓度150 μmol/L IMP和40 μmol/L Cearoin[10]的培养基培养。

1.3.4 MTT检测HL-60细胞的增殖活性:将HL-60细胞依据1.3.3分组并以每孔5×103个细胞接种至96孔板中培养48 h,同时设置只有培养基的孔作为空白对照,利用1.3.2中的MTT法评估各组HL-60细胞活性。

1.3.5 软琼脂克隆形成实验检测HL-60细胞的增殖:1.2%琼脂糖和2×1640培养基按1∶1混匀后,取3 ml加入6 cm培养皿中,静置凝固。另将0.6%琼脂糖和2×含不同药物的1640培养基在无菌管中按1∶1混匀,加入200 μl HL-60细胞悬液(1×104个/ml)再次混匀,加入上述6 cm培养皿中,凝固后置于培养箱培养15 d,肉眼对细胞克隆数量计数。

1.3.6 流式细胞仪术检测HL-60细胞凋亡:将HL-60细胞以5×105个/孔接种至6孔板,按1.3.3的分组培养24 h,然后重悬细胞并离心,收集细胞。PBS洗涤后,加入500 μl稀释的PBS重悬细胞,再加入5 μl Annexin V-FITC和5 μlPI染色液混匀,避光孵育20 min。用流式细胞仪系统检测细胞凋亡并分析凋亡率。

1.3.7 Transwell小室检测HL-60细胞迁移和侵袭能力:将HL-60细胞消化并重悬,以4×104个/孔的密度接种至Transwell上室中并加入无血清培养基,下室按照1.3.3的分组加入含有10% FBS和不同药物的培养基培养。24 h后膜外侧细胞用4%多聚甲醛固定15 min,结晶紫染色10 min。在侵袭实验中,上室加入含有基质胶(Matrigel)的无血清培养基,其余操作与迁移实验相同。显微镜下拍照并计算迁移和侵袭细胞数,每组随机选择6个视野计算平均值。

1.3.8 ELISA检测培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平:将HL-60细胞重悬,离心收集上清。然后按照ELISA试剂盒说明书相应的操作步骤检测HL-60细胞培养液的上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

1.3.9 Western blot检测通路相关蛋白ERK1/2、mTOR、p70S6K及Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达:将HL-60细胞按照1.3.3的分组培养24 h后,重悬并收集细胞,加入蛋白裂解液提取总蛋白,用BCA试剂盒测量蛋白浓度。然后利用SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白,并转至PVDF膜上。随后将PVDF膜用5%的脱脂牛奶室温振荡孵育2 h,TBST洗膜,加入一抗稀释液(ERK1/2、p-ERK1/2稀释倍数1∶10 000,mTOR、p-mTOR、p-p70S6K、Bcl-2稀释倍数1∶1 000,Beclin-1稀释倍数1∶2 000,LC3Ⅱ/Ⅰ稀释倍数1∶500)4℃孵育过夜,再加入羊抗兔二抗稀释液(稀释倍数1∶1 000),室温振荡孵育2 h,最后加入ECL试剂避光显色,凝胶成像仪观察蛋白条带。以β-actin为内参蛋白,用Gel-Pro analyzer4软件分析蛋白表达量。

2 结果

2.1 IMP对HL-60细胞毒性的影响 50、100、150、200、250 μmol/L IMP处理组的细胞存活率明显低于对照组(P<0.05);且IC50为150.3 μmol/L。因此,本实验选择剂量为50、100、150 μmol/L作为后续实验中IMP的低、中、高剂量组。见表1。

表1 IMP对HL-60细胞存活率的影响

2.2 IMP对6组HL-60细胞存活率和克隆形成的影响 与对照组比较,PD98059组和IMP低、中、高剂量组HL-60细胞存活率和克隆数量降低(P<0.05);与IMP高剂量组比较,IMP高+Cearoin组细胞存活率和克隆数量显著升高(P<0.05)。见表2,图1。

图1 6组HL-60细胞的克隆形成情况

表2 不同实验组HL-60细胞克隆数量

2.3 IMP对HL-60细胞凋亡率的影响 与对照组比较,PD98059组和IMP低、中、高剂量组HL-60细胞的凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与IMP高剂量组比较,IMP高+Cearoin组细胞的凋亡率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2,表3。

图2 不同实验组HL-60细胞凋亡情况

表3 6组HL-60细胞凋亡率

2.4 IMP对HL-60细胞的迁移和侵袭的影响 与对照组比较,PD98059组和IMP低剂量组、中剂量组、高剂量组HL-60细胞的迁移和侵袭数量显著减少,差异均有统计学意义(P<0.05);与IMP高剂量组比较,IMP高+Cearoin组细胞迁移和侵袭数量显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3,表4。

图3 IMP对HL-60细胞迁移和侵袭能力的影响

表4 6组HL-60细胞的迁移和侵袭能力n=6,个,

2.5 IMP对培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响 与对照组比较,PD98059组和IMP低、中、高剂量组培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低(P<0.05);与PD98059组比较,IMP低、中剂量组和IMP高+Cearoin组TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高(P<0.05);与IMP高剂量组比较,IMP高+Cearoin组培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平增高(P<0.05)。见表5。

表5 6组HL-60细胞培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平

2.6 IMP对HL-60细胞中MAPK/mTOR/p70S6K通路蛋白及Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达的影响 与对照组比较,IMP低、中、高剂量组HL-60细胞中ERK1/2、mTOR、p70S6K蛋白表达无显著变化,但其磷酸化形式p-ERK1/2、p-mTOR、p-p70S6K及Bcl-2蛋白表达显著降低,Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著升高(P<0.05);与IMP高剂量组比较,IMP高+Cearoin组细胞中p-ERK1/2、p-mTOR、p-p70S6K及Bcl-2蛋白表达显著升高,Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表6,图4。

图4 不同实验组HL-60细胞中MAPK/mTOR/p70S6K通路蛋白及Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达;A 对照组;B PD98059组;C IMP低剂量组;D IMP中剂量组;E IMP高剂量组;F IMP高+Cearoin组

表6 6组HL-60细胞中MAPK/mTOR/p70S6K通路蛋白及自噬蛋白的相对表达量

3 讨论

AML是一种预后较差的遗传异质性的恶性肿瘤,为成人中最常见的急性白血病[11]。在AML中,未成熟的原始细胞存在于骨髓、外周血和髓外组织中,无法分化,从而抑制机体正常的造血功能。尽管近些年诱导化疗使AML患者有所缓解,但复发也时常发生[12]。因此,迫切需要探索出治疗AML的新方案和新药物。已知香豆素具有心脏保护,抗炎,抗肿瘤等生物活性,而IMP是一种天然衍生的香豆素,存在于多种天然植物中,具有广泛的药理活性,包括抗癌和抗菌特性[13]。由于炎症与癌症的发展过程密切相关,因此TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子在AML细胞中也存在高表达[14]。本研究结果发现,与对照组比较,IMP低、中、高剂量组中HL-60细胞的存活率和克隆形成数量均逐渐降低,细胞凋亡率逐渐升高,细胞的迁移和侵袭数量以及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平显著降低,且IMP高剂量组各指标与PD98059组接近。揭示了IMP能够抑制HL-60细胞的增殖、转移及炎性因子的表达,促进细胞凋亡,从而抑制AML的发展。

MAPK作为经典的细胞磷酸化级联反应,参与生命所必需的多种细胞和生理过程,同时在多种类型的癌症发展中也具有显著作用[15]。MAPKs家族包括ERK1/2、JNK和p38三种亚家族,其中ERK1/2信号传导对人类癌细胞的存活、增殖和传播很重要[16]。mTOR是细胞生长和代谢的主要调节分子,能够参与细胞生长、迁移、分化以及自噬等各种细胞过程[17]。已知mTOR的活化能够磷酸化位于下游的p70S6K靶标,而p70S6K与肿瘤形成有关,其磷酸化后可诱导蛋白质合成和细胞存活[18]。抑制mTOR激酶活性还可以通过抑制其下游底物p70S6K促进自噬[19]。LC3是自噬体的标准标志物,Bcl-2是一种细胞凋亡保护剂,代表自噬和凋亡之间的分子联系[20]。研究发现mTOR的激活受MAPK亚家族激酶的调节,且抑制mTOR/p70S6K信号通路的激活能够促进神经母细胞瘤和胃癌细胞的自噬和凋亡[9,21]。本研究结果显示,PD98059组和IMP低、中、高剂量组中通路相关蛋白的磷酸化形式p-ERK1/2、p-mTOR、p-p70S6K以及Bcl-2水平显著降低,而自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ水平显著升高,且呈现剂量依赖性。揭示了IMP可能是通过抑制MAPK/mTOR/p70S6K信号通路激活,从而抑制HL-60细胞的增殖、迁移,促进细胞自噬和凋亡,抑制AML的发展。进一步使用ERK1/2激活剂后发现,ERK1/2激活剂可明显消除IMP对HL-60细胞生物学特性的影响。

综上所述,IMP可能通过抑制MAPK/mTOR/p70S6K通路的激活,从而抑制AML细胞的增殖、转移,促进自噬、凋亡等生物学特性。本研究为AML的治疗提供了潜在的治疗药物和思路。但本文中仅研究了MAPK/ERK信号通路的作用,还有其他几种级联反应和调节机制需要进一步深入研究和探索。