徐慧鲜 刘振锋

胃癌是世界范围内最常见的癌症之一[1]。据2020年全球癌症统计,胃癌发病率占新发癌症病例的5.6%,排第五位;胃癌死亡率占癌症总死亡病例的7.7%,排第四位[2]。中国是胃癌大国,胃癌已成为威胁国民生命健康的一大疾病,也是国家癌症防治的重点[3,4]。因此,有必要研究胃癌恶性进展的潜在机制,为胃癌治疗提供靶点。谷氨酰胺酶1(glutaminase1,GLS1)是一种代谢酶,通常在高度增殖的癌细胞中过表达,通过分解谷氨酰胺,满足癌细胞快速增殖对能量的需求[5,6]。目前,GLS1已被证实是致癌过程中的一种重要靶点,且有证据表明,GLS1的抑制剂可能是癌症治疗的有效策略[7-9]。GLS1在胃癌中被报道与胃癌患者较差的预后有关[10]。但笔者发现GLS1表达调控胃癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及上皮间充质转化(EMT)的作用尚不清楚。因此,本研究通过干扰胃癌细胞中GLS1的表达,研究GLS1表达缺失对胃癌细胞恶性行为和体内生长的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞N87、MKN28、BGC826和BGC803由中国科学院上海细胞库提供。在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素混合液的DMEM培养液中,置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。

1.2 细胞转换 设计合成2条靶向GES-1的siRNA片段(记为si-GLS1-1#和si-GLS1-2#),分别转染N87和BGC823细胞,并以无意义siRNA为对照(si-con)。转染48 h后,实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和western blot检测细胞中GLS1 mRNA和蛋白表达水平。

1.3 qRT-PCR实验 Trizol法用于提取细胞总RNA。采用Takara逆转录试剂盒将RNA样本逆转录合成cDNA。然后,采用SYBR Green法进行qRT-PCR反应。引物序列如下:GLS1正向5’- AAGAGAATGGGCTGGTGCTC-3’,反向5’-ACCGCGTAAGCAGATTTGGA-3’,内参β-actin正向5’-CTTCGCGGGCGACGAT-3’,反向5’- CCACATAGGAATCCTTCTGACC-3’。 GLS1 mRNA相对表达量采用2-ΔΔct法计算。

1.4 Western blot实验 取适量RIPA裂解液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE),然后将电泳分离的蛋白样品转移至PVDF膜。PVDF膜在5%脱脂奶粉中封闭2 h后,分别与GLS1、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin或β-actin一抗稀释液,4℃孵育过夜;然后与相应的二抗室温孵育2 h。使用ECL化学发光液检测目的条带,拍照,ImageJ软件分析目的条带的灰度值。

1.5 CCK8和克隆形成检测细胞增殖 CCK8试剂盒用于CCK8细胞增殖活性的检测。取对数生长期的细胞,消化、离心、计数、重悬,将细胞悬液以1×104个/孔播种至96孔板,37℃培养箱中孵育24 h后,每孔加入10 μl CCK8溶液,继续孵育4 h。在酶标仪下读取每孔490 nm处的吸光度值(OD值),并且计算细胞的增殖活性。此外,通过克隆形成实验评估细胞的增殖能力。将细胞以约2×102个/孔播种至6孔板,37℃培养箱中培养约2周后,采用10%甲醛溶液固定细胞,采用0.1%结晶紫染色,肉眼或在显微镜下计数克隆形成数目。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 Annexin V-FITC/PI双染法试剂盒检测细胞凋亡。收集取数生长期的细胞,用预冷的PBS洗涤细胞,加入1×Binding Buffer重悬细胞。然后分别加入5 μl的Annexin V-FITC,室温下,避光染色15 min,再加入5 μl的PI染色5 min。流式细胞仪上机检测细胞凋亡率。

1.7 Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭 将Transwell小室放入24孔培养板,Transwell小室作为上室,24孔板作为下室。用无血清的培养液重悬细胞,制备细胞悬液,取适量细胞悬液加入上室腔中,然后在下室腔中加入适量含10%胎牛血清的培养液。培养板放入37℃培养箱中培养24 h后,取出上室,倒掉上室中的液体,放入甲醇溶液中固定30 min后,放入Giemsa染液中染色15 min,流水清洗后,用湿棉棒轻轻擦去上室底部膜表面未迁移的细胞,显微镜下观察随机5个视野区的细胞,并计数,取平均数记为细胞迁移数目。细胞侵袭实验中预先在Transwell小室的底部铺一层Matrigel基质胶,其他步骤同细胞迁移。

1.8 异种移植瘤实验 将BALB/C裸鼠在本实验室适应性饲养1周后,随机分为sh-NC组、sh-GLS1-1#组和sh-GLS1-2#组,每组5只。根据分组,分别将转染对应shRNA的N87细胞经皮下接种裸鼠。分别于接种第7、14、21、28天检测小鼠体内移植瘤生长体积,接种28 d后,使小鼠安乐死,剥离移植瘤称重,并通过Western blot检测移植瘤中N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的表达。

2 结果

2.1 GLS1在胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞中的表达 qRT-PCR检测GLS1 mRNA在胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞N87、MKN28、BGC826和BGC803的表达,结果显示,与GES-1细胞比较,N87、MKN28、BGC826和BGC803细胞中GLS1 mRNA表达明显上调(P<0.05)。Western blot检测GLS1蛋白表达,结果显示,与GES-1细胞比较,N87、MKN28、BGC826和BGC803细胞中GLS1蛋白表达上调(P<0.05)。见图1,表1。

表1 GLS1在胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞的表达

图1 GLS1的蛋白表达

2.2 干扰GLS1表达对人胃癌N87和BGC823增殖的影响 qRT-PCR和Western blot结果显示,与si-con组比较,si-GLS1-1#组和si-GLS1-2#组N87和BGC823细胞中GLS1 mRNA和蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。CCK8实验显示,与si-con组比较,si-GLS1-1#组和si-GLS1-2#组N87和BGC823细胞的增殖活性均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);克隆形成实验结果显示,与si-con组比较,si-GLS1-1#组和si-GLS1-2#组N87和BGC823细胞的克隆形成数目均明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2,表2。

图2 干扰GLS1 表达对人胃癌N87和BGC823GLS1的表达和克隆形成的影响;A Western blot检测人胃癌N87和BGC823中GLS1的表达;B 克隆形成检测人胃癌N87和BGC823的增殖

表2 沉默GLS1 表达对人胃癌N87和BGC823增殖的影响

2.3 干扰GLS1 表达对人胃癌N87和BGC823细胞凋亡的影响 与si-con组比较,si-GLS1-1#组和si-GLS1-2#组N87和BGC823细胞的细胞凋亡率均明显升高(P<0.05)。见图3,表3。

图3 流式细胞术检测人胃癌N87和BGC823细胞凋亡

表3 干扰GLS1 表达对人胃癌N87和BGC823细胞凋亡的影响 n=9,

2.4 干扰GLS1 表达对人胃癌N87和BGC823迁移和侵袭的影响 Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭,结果显示,与si-con组比较,si-GLS1-1#组和si-GLS1-2#组N87和BGC823细胞的迁移细胞数目和侵袭细胞数目均减少(P<0.05)。Western blot检测EMT相关蛋白表达,结果显示,与si-con组比较,si-GLS1-1#组和si-GLS1-2#组N87和BGC823细胞中N-cadherin和Vimentin蛋白表达降低(P<0.05),而E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)。见图4,表4。

图4 干扰GLS1 表达对人胃癌N87和BGC823迁移和侵袭以及N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响;A transwell检测人胃癌N87和BGC823迁移和侵袭;B Western blot检测N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的表达

表4 干扰GLS1 表达对人胃癌N87和BGC823迁移、侵袭的影响

2.5 干扰GLS1 表达对人胃癌N87和BGC823体积和重量的影响 异种移植瘤实验观察干扰GLS1对胃癌细胞体内生长的影响,结果显示,与si-con组比较,si-GLS1-1#组和si-GLS1-2#组小鼠体内移植瘤的体积明显减小(P<0.05),肿瘤重量明显减轻(P<0.05)。见图5,表5、6。

图5 干扰GLS1 表达对人胃癌N87和B GC823细胞小鼠移植瘤的影响

表5 干扰GLS1 表达对人胃癌N87 细胞小鼠移植瘤体积和重量的影响 n=9,

表6 干扰GLS1 表达对人胃癌BGC823细胞小鼠移植瘤体积和重量的影响 n=9,

2.6 干扰GLS1 表达对人胃癌N87和BGC823移植瘤EMT表达的影响 Western blot检测移植瘤中EMT相关蛋白表达,结果显示,与si-con组比较,si-GLS1-1#和si-GLS1-2#组移植瘤中N-cadherin和Vimentin表达明显降低(P<0.05),而E-cadherin表达明显升高(P<0.05)。见图6,表7。

图6 干扰GLS1 表达对人胃癌N87和BGC823细胞小鼠移植瘤EMT表达的影响

表7 干扰GLS1表达对人胃癌N87和BGC823细胞小鼠移植瘤N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的影响 n=9,

3 讨论

谷氨酰胺代谢为癌症细胞增殖提供能量,是癌症的标志之一[11]。GLS1是催化谷氨酰胺代谢的关键代谢酶,在多种人类肿瘤中检测到GLS1的高表达,且GLS1异常表达与癌细胞的生长、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为有关[12,13]。赖明华等[14]报道,GLS1在乳腺癌细胞中高表达,抑制GLS1的表达可降低细胞增殖活性,诱导细胞凋亡。卢昭辉等[15]研究表明,人胃肠道神经内分泌肿瘤中GLS1高表达与细胞较强的增殖和侵袭能力有关。Liu等[16]发现,敲低GLS1可抑制结直肠癌细胞的增殖、集落形成和迁移能力,提示靶向GLS1可能是结直肠癌治疗的一个新的潜在靶点。目前,在胃癌中,GLS1被发现与胃癌临床预后有关,GLS1表达越高,胃癌患者的3年总生存率越低[10];此外,李家秋等[17]研究表明,靶向抑制GLS1可以抑制胃癌细胞的增殖能力。

本研究体外培养胃癌细胞,qRT-PCR检测证实GLS1在胃癌细胞中呈高表达。肿瘤细胞的迁移和侵袭是肿瘤发展过程中最具危险性的过程,当肿瘤细胞在远处器官形成克隆时,往往会对机体产生严重破坏[18,19]。本研究细胞功能研究证实,干扰GLS1不仅能够抑制胃癌细胞的增殖活性和克隆形成能力,还可抑制细胞的迁移和侵袭能力,诱导细胞凋亡。异种移植瘤实验证实干扰GLS1阻碍了胃癌细胞的体内生长。结果表明GLS1可能成为胃癌治疗的有效的治疗靶点。此外,有研究发现GLS1在癌细胞中的调控机制,如靶向GLS1可通过增加活性氧类和抑制Wnt/β-catenin途径减弱肝细胞癌的干性特征[20];GLS1的下调降低一些与癌细胞存活有关的关键癌基因(如c-Myc、cdk4、NF-kB等)的表达,抑制多发性骨髓瘤进展,延长患者生存期[21]。但GLS1在胃癌细胞进展中的调控机制有待进一步研究。

EMT是一种将黏附上皮细胞转化为侵袭性间充质细胞的生物过程,其主要表现为细胞黏附蛋白标记物E-cadherin表达降低,而间充质蛋白标记物N-cadherin和Vimentin水平升高[22,23]。数据显示,EMT是肿瘤形成和转移的关键,也是一个可逆的生物过程[24]。本研究中,我们发现干扰GLS1表达能够使胃癌细胞中N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平降低,而E-cadherin蛋白表达明显升高,表明干扰GLS1减弱了胃癌细胞的EMT过程。此外,在GLS1敲低表达的移植瘤中也检测到了N-cadherin和Vimentin蛋白表达降低,而E-cadherin蛋白表达升高。提示干扰GLS1可能通过抑制胃癌细胞的EMT过程,抑制癌细胞的迁移和侵袭。

综上所述,GLS1在胃癌细胞中呈现高表达,干扰GLS1能够抑制癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT过程,促进癌细胞凋亡,并能减缓胃癌细胞的体内生长。本研究结果为GLS1作为胃癌治疗的潜在靶点提供了实验参考。