彭静雨,梁 雪,周四元,成 颖

空军军医大学药学系药剂学与药事管理学教研室,西安 710032

干眼症又称角膜干燥症,是常见的眼部疾病。由于电子产品的过度使用、角膜接触镜的滥用等,干眼症在我国的发病率呈逐年上升的趋势,并且发病年龄有降低的趋势[1-2]。干眼症的临床表现为由泪液分泌不足或者泪液的流体力学性质改变而引起的眼睛干涩、发痒、酸胀,严重时导致角膜浑浊甚至失明[3]。炎症是干眼症的主要发病机制[4-5],环孢菌素A(cyclosporine A,CsA)能有效抑制炎症因子在眼部组织的浸润,同时提高抗炎细胞因子的释放水平,进而增加泪液的分泌,是临床治疗重度干眼症的首选药物[6]。但CsA的相对分子质量大,且由于其具有较强的亲脂性,眼部直接给药,药物与泪液的相容性差,故难以在眼部滞留,影响其发挥治疗作用[7-8]。

纳米技术是改善难溶性药物溶解性、稳定性和生物利用度的制剂新技术[9]。通过制备纳米粒能增加难溶性药物的饱和溶解度,加快其溶出速度,继而可以将其制备成适合多种给药途径的药物制剂。温敏凝胶能根据温度变化发生物理状态的改变。将眼用制剂设计为温敏凝胶,能满足药物在使用前为液体(具备良好的流动性)、眼部给药后迅速胶凝化(延长药物在眼球表面的滞留时间)的要求[10]。将纳米制剂与温敏凝胶给药系统结合,制备的CsA纳米粒眼用温敏凝胶能延长药物的作用时间,减小对眼部的刺激,提高生物利用度,更加符合临床需求。

本研究先制备CsA纳米粒,再以泊洛沙姆407(poloxamer 407,F127)、泊洛沙姆188(poloxamer 188,P188)和壳聚糖作为基质制备温敏凝胶,包裹CsA纳米粒。用中心点复合设计响应面法筛选最优的凝胶处方,并对制得的CsA眼用纳米粒温敏凝胶的释药行为及释药机制进行研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

精密水银温度计、恒温水浴锅、HMS-18型磁力搅拌器均购自上海泰坦科技股份有限公司;AL104型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);JNB10型高压均质机(广州聚能生物科技有限公司);水浴恒温振荡器(苏州培英实验设备有限公司);高效液相色谱仪(沃特世科技有限公司);纳米粒度电位仪(英国马尔文仪器有限公司);透射电子显微镜(日本日立公司);低温恒温冰箱(青岛海尔股份有限公司);高速冷冻型微量离心机(美国赛洛捷克公司);超纯水机(重庆摩尔水处理设备有限公司)。

1.2 试药

环孢菌素A(cyclosporine A,CsA,质量分数为98%,上海源叶生物科技有限公司);泊洛沙姆407(poloxamer 407,F127)、泊洛沙姆188(poloxamer 188,P188)、壳聚糖均购自德国巴斯夫公司;丙酮(天津市富宇精细化工有限公司);乙腈(赛默飞世尔科技有限公司);无水乙醇(上海泰坦科技股份有限公司);氯化钠、氯化钾、二水氯化钙、碳酸氢钠均购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 CsA纳米粒温敏凝胶的制备

2.1.1CsA纳米粒的制备 用纳米沉淀-高压均质法制备CsA纳米粒溶液。称取20 mg CsA溶于1 mL丙酮作为有机相;称取100 mg F127溶于10 mL去离子水作为水相。在室温条件下边搅拌边将有机相匀速滴入水相中。在通风橱中自然搅拌挥发丙酮,收集溶液。所得溶液用高压均质机进行粒径均化处理(设置条件:1 500 bar,均质10次,4 ℃),获得泛乳光的纳米粒溶液,见图1。如图1所示,CsA纳米粒的粒径为(220±10) nm;Zeta电位为(-10±1) mV。纳米粒的透射电镜图见图2。由图2可见,纳米粒分散均匀。用超高效液相色谱仪检测CsA纳米粒溶液中药物的质量浓度,将CsA纳米粒溶液中药物的质量浓度稀释至1 mg·mL-1。

注:A.CsA纳米粒粒径图;B.CsA纳米粒电位图。

图2 CsA纳米粒的透射电镜图

2.1.2CsA眼用纳米粒温敏凝胶的制备 用低温溶胀法制备CsA眼用纳米粒温敏凝胶。按优化处方投料比分别称取F127、P188、壳聚糖,加入相应体积的CsA纳米粒溶液中。将样品静置于4 ℃冰箱中(≥48 h),待所有凝胶基质充分溶胀,即得CsA眼用纳米粒温敏凝胶溶液。

2.2 胶凝温度的测定

2.2.1人工泪液的配制 称取氯化钠6.78 g、氯化钾1.38 g、二水氯化钙0.08 g、碳酸氢钠2.18 g,用去离子水溶解并定容至1 000 mL,振荡至溶液澄清无颗粒[11],即得。

2.2.2原始胶凝温度T1的测定 将精密温度计插入制备好的CsA纳米粒温敏凝胶溶液中,一并置于恒温水浴锅(起始温度为20 ℃,设定温度为50 ℃)中缓慢升温。将试管倾斜90°观察液体流动情况,以玻璃棒搅动难易程度确定胶凝温度。

将试管倾斜90°,当药液呈半固体凝胶状无流动、用玻璃棒搅动药液有轻微阻力感时,记录温度计读数。取出试管自然冷却至药液恢复呈液体状,再次记录温度计读数。平行测量3次,计算3次的平均值,即为胶凝温度。

2.2.3用模拟人工泪液稀释后胶凝温度T2的测定 将CsA眼用纳米粒温敏凝胶溶液与人工泪液按照40∶7的体积比混匀[12],按照2.2.2项下的方法测定用模拟人工泪液稀释后的胶凝温度T2。

2.3 处方优化

2.3.1实验设计 采用软件Design Expert 13以中心点复合响应面法设计3因素5水平实验[13]。选取对CsA眼用纳米粒温敏凝胶的胶凝温度影响显著的3个因素,即F127、P188、壳聚糖的质量占比为自变量。根据预实验结果,在满足实验目的前提下,确定自变量的取值区间依次为18%～28%、0～8%、1%～4%。根据软件内置代码±α(α=1.68),±1,0设计5水平实验,见表1[14-15]。胶凝温度为测量指标,具体处方和结果见表2。

表1 3因素5水平实验设计

表2 中心点复合响应面法实验设计结果 (n=3)

2.3.2模型拟合 用Design Expert 13软件,以实验变量为自变量,以胶凝温度为因变量,分析自变量与因变量的关系,拟合方程建立线性回归。其中x1表示F127的质量占比,x2表示P188的质量占比,x3表示壳聚糖的质量占比。

T1=25.41-5.26x1+3.78x2-1.52x3-1.3x1x2+0.254 2x1x3+0.195 8x2x3+1.29x12+0.331 1x22-0.042 4x32

T2=33.54-7.62x1+4.06x2-1.09x3+0.566 7x1x2+1.04x1x3+0.058 3x2x3+1.56x12-0.009 4x22-0.233 3x32

胶凝温度模型方差分析结果见表3。由表3可知,R2>0.9并且信噪比>4,表明T1和T2模型的拟合度好。P<0.01且F值显著,表明模型稳定性好。失拟误差显著(>0.1)表明拟合的模型效果好。以二次多项式方程为数学模型绘制三维响应面图,见图3。由图3可见,当壳聚糖质量占比为定量时,F127和P188的质量占比对胶凝温度的影响较大。经模拟泪液稀释后,各实验组的胶凝温度均有不同程度的升高,见图4。加入泪液后,壳聚糖的质量占比对胶凝温度的影响增大。

表3 胶凝温度模型方差分析

图3 F127、P188、壳聚糖质量比对T1的三维响应面图

图4 F127、P188、壳聚糖质量比对T2的三维响应面图

2.3.3响应面优化与工艺验证 构建模型的最终目的是设计符合眼部给药要求的凝胶制剂,满足凝胶制剂在储存条件下具有良好的流动性、在眼部给药后相变为半固体状态、形成药物储库的要求。有文献报道,将T1控制在25～30 ℃、T2控制在30～35 ℃是眼用凝胶制剂的理想状态。设置25 ℃≤T1≤30 ℃、30 ℃≤T2≤35 ℃的目标范围,软件给出的100个符合条件的凝胶处方,从中任意挑选4个处方,按照2.1.2项下的方法制备凝胶,验证该模型的可靠性,见表4。如表4所示,4个凝胶处方实测值与预测值的偏差在可接受的范围内(±5%)。其中处方4的制剂产品符合理想眼用凝胶制剂的标准。最终确定F127、P188与壳聚糖的质量比为22.108∶1.754∶1.734。

表4 凝胶处方验证 (n=4)

2.4 体外评价

2.4.1凝胶溶蚀考察 称取适量CsA眼用纳米粒温敏凝胶,置于西林瓶中预先胶凝化,平行制备3份。将人工泪液作为溶蚀介质,沿瓶壁加入提前保温的人工泪液,再一并置于恒温水浴振荡器中振荡溶蚀,每隔30 min将溶蚀介质全部取出,称取西林瓶的质量,再加入新鲜人工泪液3 mL继续振荡溶蚀。结果见图5。由图5可知,CsA眼用纳米粒温敏凝胶的时间-凝胶溶蚀率曲线呈线性关系,7 h内CsA眼用纳米粒温敏凝胶的体外溶蚀率达75%。

图5 CsA眼用纳米粒温敏凝胶体外溶蚀曲线

2.4.2凝胶释药行为及机制研究 称取适量CsA眼用纳米粒温敏凝胶预先胶凝化,平行制备3份。为满足漏槽条件,以含有体积分数10%乙醇的人工泪液作为释药介质。

沿壁加入提前保温的人工泪液,再一并置于恒温水浴振荡器中振荡,分别在0.5、1、2、4、8、20、24 h取释放介质,处理后注入超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography, UPLC)系统进行分析。色谱条件:色谱柱为ACQUITY BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流动相为乙腈-水(85∶15);检测波长为210 nm;柱温为50 ℃;流速为0.2 mL·min-1;进样量为5 μL。释药结果见图6,在满足漏槽条件的前提下,24 h凝胶累积释放度能达到90%以上,CsA眼用纳米粒温敏凝胶具有缓释的作用。

图6 CsA眼用纳米粒温敏凝胶的体外释药曲线

为了阐明CsA眼用纳米粒温敏凝胶的释药机制,用DD.solver.1.0软件对释药曲线进行拟合,经过对相关系数进行比较,确定CsA眼用纳米粒温敏凝胶释药曲线满足Peppas-Sahlin模型(R2=0.998 8),释药方程为F=11.307t0.877-0.352t1.754,见图7。表明药物的释放机制为非Fick扩散,释药是扩散与溶蚀并存的过程[16-17]。

图7 释药曲线拟合模型——Peppas-Sahlin模型

3 讨论

CsA水溶性差,直接制备CsA温敏凝胶,药物的含量极低,为了解决药物溶解性的问题,实验采用纳米化技术提高CsA在溶液中的溶解度。温敏凝胶的三维网状结构使药物纳米粒嵌入凝胶的网状结构中,从而达到缓释的效果[18]。二者结合满足理想眼部给药系统的条件。

F127和P188是常用的凝胶基质,对黏膜的刺激性小且安全性高[19]。壳聚糖的生物相容性好、眼部耐受性高。此外,研究发现壳聚糖能够作为药物穿过角膜屏障的促进剂,能延长药物在眼球表面的停留时间,增加药物在眼内的渗透性,提高药物的生物利用度[20-21]。本研究结果显示,F127与壳聚糖的质量比增大会使胶凝的温度降低,而P188则相反。因此,调整3种辅料的质量比能改变CsA眼用纳米粒温敏凝胶的温度,制备出理想的能够在眼部温度下成功胶凝的温敏凝胶。本实验研究3个变量对凝胶温度的影响,不同于单因素实验中自变量与因变量一对一的关系,多因素之间由于存在交互作用,变量与胶凝温度的关系无法用二维关系表示,因此需要运用专业软件Design Expert 13设计三维响应面构建凝胶处方优化模型。

温敏凝胶溶蚀速度受多个因素影响,包括凝胶溶蚀面积、振荡频率和溶蚀温度等。总体而言,在满足漏槽条件的情况下,凝胶溶蚀量与时间呈一次线性关系。温敏凝胶的释药行为呈现出缓释的效果,释药机制研究结果显示,凝胶释药是溶蚀和扩散并存的过程。

综上所述,CsA眼用纳米粒温敏凝胶具有较理想的凝胶温度和缓释作用。后续还需要在细胞和动物水平对该制剂的安全性和有效性进行进一步评价。