陆 游,吴桂凡*,李 立,罗 轶,马双成

1.广西壮族自治区食品药品检验所 国家药品监督管理局中药材质量监测与评价重点实验室,南宁 530021; 2.中国食品药品检定研究院,北京 100050

更年灵胶囊是临床治疗妇女更年期综合征(menopausal syndrome,MPS)的常用药,具有较好的治疗效果,其为中西复方制剂,主要由2味中药女贞子、淫羊藿加水煎煮,加入维生素B1、维生素B6、谷维素及辅料制成。该药具有温肾益阴、调补阴阳之功效,主要用于妇女MPS属阴阳两虚者的治疗。

MPS是指妇女绝经前后因机体的雌激素水平变化所致的一系列以自主神经系统功能紊乱为主、伴有神经心理症状的一组症候群[1]。近年来研究发现,补肾中药可提高下丘脑-垂体-靶腺轴的功能,调节性激素水平,故以补肾调冲法作为治疗MPS的基本法则[2-3]。更年灵胶囊中的女贞子、淫羊藿均属于补肾中药,不仅能调理肾功能,还能补肾阴、消除虚弱,在妇女MPS的治疗中发挥着重要的作用,故女贞子和淫羊藿的质量对更年灵胶囊的质量控制起着决定性的作用,本品现执行的质量标准收载于《中国人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第十四册[4],仅收载了性状、理化鉴别,淫羊藿的薄层鉴别,淫羊藿苷、维生素B1、维生素B6的高效液相色谱法及谷维素的紫外-可见分光光度法,未对女贞子及淫羊藿中具有重要生物活性的朝藿定B、朝藿定C进行含量控制。为更好地控制更年灵胶囊的质量,参考2020年版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)及其他文献[5-8],拟对现行质量标准进行补充、修订,探索含量测定项目的指标性成分,研究建立更年灵胶囊指纹图谱,并用ChemPattern化学计量学软件对结果进行聚类分析和主成分分析,以考察更年灵胶囊的整体质量,为标准的制定提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(配置安捷伦液相色谱系统化学工作站、DAD检测器)购自美国安捷伦公司;ML204型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);KQ-800DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);ChemPattern化学计量学软件[科迈恩(北京)科技有限公司]。

1.2 试药

对照品:特女贞苷(批号11926-2014605,质量分数为93.3%)、朝藿定C(批号111780-201503,质量分数为95.5%)、淫羊藿苷(批号110737-201516,质量分数为94.2%)均购自中国食品药品检定研究院;朝藿定B(批号110623-73-9,Stanford Analytical Chemicals Inc.);乙腈为色谱纯;水为高纯水;其他试剂均为分析纯。

20批更年灵胶囊均为国家评价性抽验的样品,用编号S1～S20表示。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Capcellpak MGII-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流动相为乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0～10 min,5%A;10～60 min,5%～32%A;60～80 min,32%～40%A;80～90 min,40%～70%A;90～91 min,70%～5%A;91～100 min,5%A)。流速为1.0 mL·min-1;柱温为30 ℃;检测波长为224 nm;进样量为10 μL。理论板数以特女贞苷峰计算不得低于10 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液 取对照品特女贞苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL含特女贞苷80 μg、朝藿定B 40 μg、朝藿定C 80 μg、淫羊藿苷80 μg的混合溶液,即得。

2.2.2供试品溶液 取样品(编号S1)0.5 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,称定质量,超声处理(功率为320 W,频率为40 kHz)30 min,放冷,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,即得。

2.2.3阴性样品溶液 按照2020年版《中国药典》一部中更年灵胶囊的处方工艺,分别制备缺女贞子和淫羊藿的阴性样品,按照2.2.2项下方法制备,即得。

2.3 含量测定

2.3.1专属性考察 精密吸取混合对照品、供试品、阴性样品溶液适量,按照2.1项下色谱条件进样测定,结果显示,在阴性对照色谱中,与特女贞苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷对照品色谱峰对应的位置上未检出色谱峰,见图1。表明阴性对照无干扰。

注:1.特女贞苷;2.朝藿定B;3.朝藿定C;4.淫羊藿苷;A.混合对照品溶液;B.供试品溶液;C.缺女贞子和淫羊藿的阴性对照溶液。

2.3.2线性关系考察 精密称取特女贞苷对照品10.31 mg、朝藿定C对照品10.41 mg和淫羊藿苷对照品10.31 mg,置于25 mL量瓶中,另精密称取朝藿定B对照品9.16 mg,置于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密吸取5.00 mL加入上述25 mL量瓶中,再用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液。精密量取该储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分别置于10 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得系列质量浓度的对照品溶液。分别精密吸取不同质量浓度的对照品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图及峰面积。以对照品质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(x)、峰面积(y)为纵坐标,进行线性回归,结果见表1。由表1可知,各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.3.3精密度实验 取样品(编号S1),按照2.2.2项下方法制备供试品溶液,在2.1项色谱条件下连续进样6次,记录其色谱图及峰面积。测得特女贞苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷峰面积的RSD值分别为0.74%、1.34%、1.74%、1.96%,结果表明,该方法的精密度良好。

2.3.4稳定性实验 取样品(编号S1),按照2.2.2项下方法制备供试品溶液,于0、7、13、24、48 h 在2.1项色谱条件下进样测定,测得特女贞苷、淫羊藿苷、朝藿定B、朝藿定C峰面积的RSD值分别为1.68%、1.15%、2.47%、1.37%。结果表明,供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.5重复性实验 取样品(编号S1)6份,每份约0.5 g,按照2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液,在2.1项色谱条件下进样测定,记录色谱图。测得每粒胶囊特女贞苷、淫羊藿苷、朝藿定B、朝藿定C含量的RSD值分别为1.91%、2.06%、1.63%、2.42%,结果表明,该方法的重复性良好。

2.3.6加样回收实验 取已知含量的样品(编号S1),精密称取约0.25 g,置于具塞锥形瓶中,精密加入对照品储备液25 mL(精密称取特女贞苷对照品10.46 mg、朝藿定C对照品10.52 mg,置于200 mL量瓶中,另精密称定淫羊藿苷对照品11.36 mg,置于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密吸取5.00 mL,加入上述200 mL量瓶中,再精密吸取2.3.2项下的朝藿定B对照品溶液2.00 mL,加入上述200 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液),按照2.2.2项下方法制备供试品溶液。在2.1项色谱条件下进样测定,计算回收率。计算得特女贞苷、淫羊藿苷、朝藿定B、朝藿定C的平均加样回收率分别为102.77%、98.88%、98.14%、97.10%,RSD值分别为1.24%、1.53%、1.72%、1.86%,见表2。

表2 4种成分的回收率实验结果 (n=6)

2.3.7样品含量测定 按照2.2.2项下方法制备20批供试品溶液,在2.1项色谱条件下连续进样测定,结果见表3。

表3 各成分含量测定结果 (n=20)

2.4 指纹图谱建立

2.4.1图谱生成 取20批更年灵胶囊样品,分别按照2.2.2项下方法制备供试品溶液,精密吸取10 μL,按照2.1项下色谱条件进样测定,记录色谱图,将各样品的色谱图导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)”中,设定11个响应较高的色谱峰,选择MARK峰匹配方式,生成更年灵胶囊的对照指纹图谱,见图4。根据20批更年灵胶囊的指纹图谱检测结果,共标定11个特征峰。经与对照品比对,可知4号峰为特女贞苷、7号峰为朝藿定B、8号峰为朝藿定C、9号峰为淫羊藿苷。见图2。

注:4.特女贞苷;7.朝藿定B;8.朝藿定C;9.淫羊藿苷;其他数字为未指认成分峰。

2.4.2主成分分析 用ChemPattern 软件将样品测定数据自动标度化后(针对观测)进行主成分分析,见图3。第1主成分(PC1)的贡献率为70.73%,第2主成分(PC2)的贡献率为19.22%,第3主成分(PC3)的贡献率为5.59%,累积达到95.54%,表明其能较全面地反映样品间的差异。企业Q1的样品基本能聚为一类;可能由于特女贞苷、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷的含量差异,企业Q2的S8、S10、S13、S154批样品不能聚为一类,企业Q3的S17、S19批样品不能聚为一类。

图3 20批样品的主成分分析

2.4.3聚类分析 用ChemPattern 软件将样品测定数据自动标度化后(针对观测)进行聚类分析,见图4。由图4可见,企业Q1的样品能聚为一类,而其他样品批间差异较大,不能聚为一类。

图4 20批样品的聚类分析

3 讨论

本研究用DAD检测器检测,提取各波长下的色谱图,在224 nm波长处所得色谱峰的信息量最多,各色谱峰的面积、高度适中,分离度好,所以确定检测波长为224 nm;参照《中国药典》中女贞子和淫羊藿项下的方法,分别用甲醇-水和乙腈-水系统进行梯度洗脱,经研究,确定流动相梯度为2.1项色谱条件下的梯度,在此梯度下,得到的色谱峰数量多、分离效果好、峰形对称;考察了甲醇-水、甲醇-4 mL·L-1磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-4 mL·L-1磷酸溶液等由不同系统组成的流动相,结果显示,乙腈-水系统梯度洗脱程序能将各成分有效分离。在色谱柱的选择上,考察了Waters XBridge C18、Kromasil C18、Thermo C18、 Hubble C18、Capcellpak MGII-C18,结果显示,使用5种色谱柱均能获得很好的分离效果,各峰之间的分离度良好。5种不同品牌色谱柱特女贞苷的理论板数均超过30 000,故确定特女贞苷峰的理论板数不得低于10 000。

4 小结

中药化学成分复杂,并具有多靶点的特点,因此对其进行质量控制不能仅基于单一的指标,尤其对于中药复方制剂更是如此。在辨证审因决定治法后,遵循君臣佐使和七情配伍等原则,针对病情设定的由2味或2味以上药味组成的方剂,因所含化学成分复杂、各种药物化学成分相互作用,对于其质量评价需要提出更深层次的要求[9-10]。更年灵胶囊的现行质量标准仅收载了性状、理化鉴别和淫羊藿的薄层鉴别,女贞子、淫羊藿为处方中的主要药材,标准中并未对其进行含量控制。检验项目的缺失,导致有的生产企业可能偷工减料导致产品质量状况较差,无法保证药品的疗效。2020年版《中国药典》中用特女贞苷、淫羊藿苷分别作为女贞子、淫羊藿质量定量评价的指标[11],淫羊藿中的朝藿定B、朝藿定C都具有重要的生物活性,且药理活性显著[12-14],目前研究发现,朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷是淫羊藿的标志性化合物[15],因此,本研究经综合考察,建立同时测定女贞子中特女贞苷和淫羊藿中淫羊藿苷、朝藿定B、朝藿定C含量的方法,以客观地反映女贞子和淫羊藿的质量情况。近年来,指纹图谱结合模式识别方法已广泛应用于中药材的质量控制、来源分析及差异标志物筛选等,能有效弥补现有质量控制方法的不足[16-20]。本研究建立的更年灵胶囊HPLC指纹图谱分析方法精密度高、专属性强、稳定性和分离度好。通过比较,确定了11个共有峰,指认了4个峰。结合化学计量学方法进行聚类分析、主成分分析,由分析结果可知,3家企业中有1家企业不同批次样品的相似度接近,表明该企业的原料和生产工艺相对稳定;不同企业间的产品质量存在差异,另2家企业样品间的主要成分含量也存在差异。

因此,为了对更年灵胶囊质量进行整体、综合性地控制,全面控制样品的均一性和有效性,建议增加特女贞苷、淫羊藿苷、朝藿定B和朝藿定C 4种成分的含量测定及指纹图谱检查,以更科学、系统地控制更年灵胶囊的质量。