陈雪红 吴子东 庄海容 陈圣文

(海南医学院第二附属医院眼科,海南 海口 570000)

糖尿病是一种慢性全身性疾病,其眼部并发症,如白内障,可导致严重的视力障碍〔1〕。在全球人群中,白内障是导致失明的主要原因,与其他人群相比,糖尿病患者白内障的发病率更高〔2〕。预计到2040年将有超过6亿人患有糖尿病,并且由于糖尿病患者的寿命越来越长,患有糖尿病视网膜病变和视力障碍的人数预计将迅速增加〔3〕。糖尿病性白内障(DC)是糖尿病最重要的并发症之一,会导致严重的视力丧失;晶状体上皮细胞(LEC)的病理改变是糖尿病患者发生DC的直接原因,当人LEC暴露于高糖(HG)条件下,会发生凋亡和氧化应激,参与DC的形成〔4〕;但具体机制尚不十分清楚。

非编码RNA(ncRNA)在DC的发展中起着关键作用,ncRNA的异常表达可导致LEC发生细胞凋亡、焦亡及自噬异常,使晶状体透明度下降,从而导致白内障的发生〔5,6〕。共价闭合单链环状RNA(circRNA)是一类新发现的内源性RNA,通过海绵吸附微小RNA(miRNA)参与各类疾病的病理过程。KMT2E,又称MLL5,是影响糖尿病视网膜神经血管单元损伤的调节基因之一〔7〕。研究显示,环状RNA KMT2E(circ KMT2E)在DC晶状体中上调,miR-204-5p在DC中呈低表达,circ KMT2E可能作为miR-204-5p的海绵分子参与DC的发病,为DC的非手术治疗提供新的靶点〔8〕。但是,circ KMT2E对DC发生发展的调控机制尚有待阐明,其是否参与LEC的凋亡仍不清楚。基质金属蛋白酶(MMP)9在DC的LEC中表达增加,并在DC的发生发展中起重要作用〔9〕;而且MMP9和miR-204-5p之间存在结合位点,miR-204-5p可直接靶向MMP9基因,调节人视网膜母细胞瘤细胞的增殖和侵袭〔10,11〕。本研究探讨HG条件下人LEC中circ KMT2E和miR-204-5p的表达及其对LEC凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 人晶状体上皮细胞系(HLE-B3)购自美国ATCC,细胞在含有10%胎牛血清和1%抗生素(青霉素G 100 U/ml,链霉素100 μg/ml)的低葡萄糖DMEM培养基中在37 ℃,5% CO2的湿润环境中培养。培养的HLE-B3细胞在达到80%～90%汇合时进行传代。使用2～5代的细胞进行实验。

胎牛血清、低糖DMEM培养基购自美国Gbico公司;葡萄糖粉(G8150)购自北京Solarbio公司;Lipofectamine3000转染试剂(L3037)购自Sigma-Aldrich;用于KMT2E敲低的siRNA(si-KMT2E)及其阴性对照、circ KMT2E过表达质粒(pcDNA3.1-KMT2E)及其阴性对照、miR-204-5p mimic及其阴性对照(miR-NC)、实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)引物均由RiboBio(中国广州)合成;TRIzol试剂(RR420A)、逆转录(PrimeScript RT)试剂盒(RR037A)、SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒(RR390A)购自日本TaKaRa公司;RIPA裂解液(P0013B)、CCK-8(C0038)和二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(P0010)购自碧云天生物科技公司;兔源一抗MMP9(ab283575)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2(ab194583)、Bcl-2相关X蛋白(Bax,ab32503)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase)-3(ab2302)、GAPDH(ab128915)、山羊抗兔IgG H&L辣根过氧化物酶(HRP,ab205718)购自英国abcam公司。

细胞培养箱、NanoDrop ND-2000分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司);iMark680多功能酶标仪、FACSCanto Ⅱ流式细胞仪(美国Bio-Rad公司);ABI Prism®7300型荧光定量PCR系统(美国应用生物系统公司);BX61电动显微镜(日本Olympus公司)。

1.2实验方法

1.2.1临床样本采集 收集自2018年12月至2020年11月在海南医学院第二附属医院眼科中心进行白内障手术的33例非DC患者(男18例,女15例;年龄52～60岁)和33例DC患者(男16例,女17例;年龄45～56岁)的晶状体前囊膜。本研究遵循修订后的赫尔辛基宣言原则,经医院伦理委员会批准。在获得患者知情同意的情况下收集所有样品。患者都接受了完整的术前眼科检查,晶状体前囊膜样本通过完整的连续曲线撕囊术获得,没有血管接触或虹膜或其他眼内结构的损伤。非DC患者作为对照组,有糖尿病但无增殖性糖尿病视网膜病变的患者作为DC组。DC组均为2型糖尿病,根据晶状体混浊分类系统Ⅲ,患者均Ⅲ级皮质性白内障。接受眼科手术或非糖尿病性视网膜病变的眼部疾病患者被排除在研究之外。

1.2.2LEC凋亡检测 将部分晶状体前囊膜置于4 ℃、4%多聚甲醛溶液中固定12 h,常规石蜡包埋后连续切片备用。然后按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作,光学显微镜下观察LEC凋亡情况(凋亡细胞呈棕黄色)并拍照。

1.2.3RT-qPCR检测晶状体前囊膜中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9 mRNA表达水平 取部分晶状体前囊膜,使用TRIzol试剂提取总RNA,分光光度计检查RNA浓度。使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。使用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒进行RT-qPCR。RT-qPCR使用以下热循环条件:95 ℃初始变性3 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s和72 ℃ 1 min的40个循环。使用2-ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达水平,用内部参考基因GAPDH或U6进行标准化。引物序列:circ KMT2E正向:5′-TCAGAGGAGCAGATTGCAGA-3′,反向:5′-CGCATAGG-GCAAACCAAT-3′;miR-204-5p正向:5′-ACACTCCAGCTGGGTTCCCTTGTCATCCTAT-3′,反向:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;MMP-9正向:5′-AGACCTGGGGCAGATTCCAAAC-3′,反向:5′-CGGCAAG-TCTTCCGAGTAGT-3′;U6正向:5′-GCTTC-GGCAGCACATATACTAAAAT-3′,反向:5′-CGCTTCACGAA-TTTGCGTGTCAT-3′;GAPDH正向:5′-CTTTGGTAT-CGTGGAAGGACTC-3′,反向:5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3′。

1.2.4高糖浓度及作用时间的筛选 取生长状态良好的HLE-B3细胞,弃去培养基,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后,胰酶消化离心,用含10%胎牛血清的低糖培养基(5 mmol/L)重悬,然后进行细胞计数。以1×103个细胞/孔的密度接种于96孔板中,放入37 ℃,5%CO2的培养箱中进行培养,24 h后,加入不同葡萄糖浓度(终浓度为25、50、100、200 mmol/L)的DMEM培养基,继续培养0、24、48 h后,每孔加入10 μl CCK-8试剂,继续培养2 h。使用酶标仪在450 nm波长下检测各孔光密度(OD)值。OD值越大,表示细胞活力越强。

1.2.5细胞分组与转染 取生长状态良好的HLE-B3细胞,接种于24孔板中(2×106个细胞/孔),培养24 h待细胞融合到80%时,进行转染。实验分为8组:对照组(正常葡萄糖5 mmol/L处理24 h,不进行转染)、HG组(高浓度葡萄糖200 mmol/L处理24 h,不进行转染)、沉默对照组(转染si-KMT2E阴性对照)、KMT2E沉默组(转染si-KMT2E)、过表达对照组(转染pcDNA3.1-KMT2E阴性对照空载体质粒)、KMT2E过表达组(转染pcDNA3.1-KMT2E质粒)、KMT2E过表达+miR-NC组(pcDNA3.1-KMT2E质粒和miR-204-5p mimic阴性对照miR-NC共转染HLE-B3细胞)、KMT2E过表达+miR-204-5p模拟物组(pcDNA3.1-KMT2E质粒和miR-204-5p mimic共转染HLE-B3细胞),转染按照Lipofectamine3000试剂说明进行。转染后将HLE-B3细胞用含高浓度葡萄糖200 mmol/L的培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h。收集细胞,RT-qPCR检测转染后各组细胞中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9 mRNA表达水平,验证转染效果,检测步骤同1.2.3。

1.2.6CCK-8法检测细胞活力 HLE-B3细胞按照1.2.5中步骤处理,高浓度葡萄糖培养基培养24 h后,每孔加入10 μl CCK-8试剂,继续培养2 h。使用酶标仪在450 nm波长下检测各孔OD值。

1.2.7流式细胞术检测细胞凋亡 HLE-B3细胞按照1.2.5中步骤处理,高浓度葡萄糖培养基处理24 h后,胰蛋白酶收集细胞,PBS洗涤后悬浮在结合缓冲液中。然后,将细胞(5×105个细胞)与5 μl 膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(FITC)和5 μl碘化丙啶(PI)一起在室温下避光孵育15 min。使用流式细胞仪鉴定和分析凋亡细胞的百分比(凋亡率)。

1.2.8Western印迹检测细胞中MMP9、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达 HLE-B3细胞按照1.2.5中步骤处理后,使用RIPA缓冲液提取细胞蛋白质。BCA试剂盒定量蛋白质浓度,取等量的蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),然后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。随后,将PVDF膜在室温下用5%脱脂牛奶室温封闭1 h,与MMP9、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、GAPDH一抗(1∶1 000)在4 ℃下孵育过夜。然后,将PVDF膜在TBST中洗涤并与HRP标记的二抗(1∶5 000)在室温下孵育2 h。增强型化学发光试剂盒(ECL)显色,观察这些膜中的蛋白质。蛋白条带的灰度值由ImageJ软件确定,以GAPDH为内参,通过与内参的灰度比,得出目的条带的相对表达水平。

1.2.9双荧光素酶报告基因检测 Starbase v2.0数据库(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)预测miR-204-5p和circ KMT2E的潜在靶序列。将KMT2E的野生型(WT)或突变型(MUT)3′-非翻译区插入包含海肾荧光素酶的pmirGLO载体中以构建KMT2E-WT或KMT2E-MUT质粒。然后将HLE-B3细胞(1×105个细胞/孔)接种到24孔板中,分为miR-NC组和miR-204-5p mimic组,使用Lipofectamine3000将KMT2E-WT、KMT2E-MUT分别与miR-NC、miR-204-5p mimic共转染到HLE-B3细胞,在37 ℃下孵育48 h后,使用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性;海肾荧光素酶活性用作标准化。

1.3统计学分析 所有实验进行3次。采用SPSS20.0和GraphPad Prism8.0软件进行t检验,方差分析,组间有差异进一步采用SNK-q检验进行两两比较。采用Pearson法分析DC患者晶状体前囊膜中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9表达水平的相关性。

2 结 果

2.1晶状体前囊膜中LEC凋亡率 与对照组〔(21.40±2.73)%〕相比,DC组晶状体前囊膜中LEC凋亡率〔(35.02±3.68)%〕显著升高(t=17.076,P<0.01),见图1。

图1 两组晶状体前囊膜(TUNEL染色,×200)

2.2晶状体前囊膜中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9 mRNA表达水平 与对照组相比,DC组晶状体前囊膜中circ KMT2E、MMP9 mRNA表达水平显著升高,miR-204-5p水平显著降低(均P<0.01),见表1。

表1 两组晶状体前囊膜中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9 mRNA表达

2.3DC组晶状体前囊膜中circ KMT2E与miR-204-5p、MMP9 mRNA表达量的相关性 DC组晶状体前囊膜中circ KMT2E与miR-204-5p表达呈负相关(r=-0.874,P<0.01),miR-204-5p与MMP9 mRNA呈负相关(r=-0.963,P<0.01),circ KMT2E与MMP9 mRNA表达呈正相关(r=0.842,P<0.01)。

2.4最佳高糖浓度及作用时间 与低糖组相比,25、50、100、200 mmol/L浓度的葡萄糖作用于HLE-B3细胞后,在200 mmol/L作用24、48 h可显著抑制HLE-B3细胞活力(P<0.05),见表2;因此,选择200 mmol/L葡萄糖作用24 h为造模条件进行后续实验。

表2 不同浓度葡萄糖对HLE-B3细胞活力的影响

2.5转染后各组细胞中circ KMT2E、miR-204-5p、MMP9 mRNA和蛋白表达水平 与对照组相比,HG组circ KMT2E、MMP9 mRNA和蛋白表达水平显著升高,miR-204-5p水平显著降低(P<0.05);与HG组相比,KMT2E沉默组circ KMT2E、MMP9 mRNA和蛋白表达水平显著降低,miR-204-5p水平显著升高(P<0.05),KMT2E过表达组、KMT2E过表达+miR-NC组、KMT2E过表达+miR-204-5p模拟物组circ KMT2E、MMP9 mRNA和蛋白表达水平显著升高,miR-204-5p水平显著降低(P<0.05);与KMT2E过表达组相比,KMT2E过表达+miR-204-5p模拟物组MMP9 mRNA和蛋白表达水平显著降低,miR-204-5p水平显著升高(P<0.05),见图2、表3。

表3 各组HLE-B3细胞中circ KMT2E、miR-204-5p、MMP9 mRNA和蛋白表达比较

1～8:对照组、HG组、沉默对照组、KMT2E沉默组、过表达对照组、KMT2E过表达组、KMT2E过表达+miR-NC组、KMT2E过表达+miR-204-5p模拟物组;图4同图2 各组HLE-B3细胞中MMP9蛋白表达

2.6各组细胞活力与凋亡率 与对照组相比,HG组细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.05);与HG组相比,KMT2E沉默组细胞活力显著升高,细胞凋亡率显著降低(P<0.05),KMT2E过表达组、KMT2E过表达+miR-NC组、KMT2E过表达+miR-204-5p模拟物组细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.05);与KMT2E过表达组相比,KMT2E过表达+miR-204-5p模拟物组细胞活力显著升高,细胞凋亡率显著降低(P<0.05),见图3、表4。

表4 各组HLE-B3细胞活力、凋亡率、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达比较

图3 各组HLE-B3细胞凋亡率

2.7各组细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达 与对照组相比,HG组Bcl-2表达显著降低,Bax、Cleaved Caspase-3表达显著升高(P<0.05);与HG组相比,KMT2E沉默组Bcl-2表达显著升高,Bax、Cleaved Caspase-3表达显著降低(P<0.05),KMT2E过表达组、KMT2E过表达+miR-NC组、KMT2E过表达+miR-204-5p模拟物组Bcl-2表达显著降低,Bax、Cleaved Caspase-3表达显著升高(P<0.05);与KMT2E过表达组相比,KMT2E过表达+miR-204-5p模拟物组Bcl-2表达显著升高,Bax、Cleaved Caspase-3表达显著降低(P<0.05),见表4、图4。

图4 各组Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达

2.8双荧光素酶报告基因检测结果 Starbase数据库预测分析结果显示miR-204-5p包含circ KMT2E的结合序列,见图5。双荧光素酶报告基因检测结果显示,转染后,与miR-NC组相比,miR-204-5p mimic组KMT2E-WT细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.01),KMT2E-MUT细胞的荧光素酶活性未受影响(P>0.05),见表5。

表5 两组细胞中荧光素酶活性

图5 miR-204-5p与circ KMT2E的结合序列预测

3 讨 论

白内障或晶状体混浊是世界上导致失明的主要原因。年龄和糖尿病是主要的危险因素,随着老龄化和糖尿病人口的增加,白内障的负担将会增加。白内障手术是恢复视力的有效方法;然而,相比于非DC患者,DC患者术后视力改善效果较差,术后渗漏发生率及黄斑中心厚度增加更明显〔12〕。因此,需要探索创新的治疗靶点。

近年来,ncRNA在DC形成机制中的研究越来越受到关注。miRNA是小的ncRNA,它通过转录后抑制翻译来调节目标mRNA的表达。研究表明,miRNA可能通过调节众多基因的表达而直接或间接参与多种疾病。已知LEC凋亡是DC的主要发病因素,MMP是一种分解LEC细胞外基质的酶。MMP-9的高表达与DC相关,并且抑制LEC中的MMP-9是预防白内障的潜在治疗策略〔9,13,14〕。据报道,miR-204-5p与白内障的发病机制有关,可调节白内障氧化应激相关基因的表达〔15〕;也有报道称miR-204-5p与糖尿病性角膜病变有关〔16〕;更重要的是,miR-204-5p可靶向调节MMP9的表达〔10,11〕。Fan等〔8〕对人DC晶状体组织中miRNA的表达谱进行了研究,发现miR-204-5p是前五位下调的miRNA之一。本研究结果表明,miR-204-5p低表达可能与LEC凋亡相关。

circRNA 3′端和5′端共价连接成环状,形成了一类最近被鉴定为在生物系统中广泛且丰富的RNA。circRNA可以作为miRNA的海绵来减轻miRNA对其靶mRNA的抑制,从而参与各种疾病的病因和进展。据报道,在人类晶状体组织中,circHIPK3沉默可上调miR-193a的表达,然后通过circHIPK3/miR-193a/CRYAA调节网络增加人LEC的凋亡〔17〕。KMT2E是编码赖氨酸N-甲基转移酶(KMT)2家族的一个成员,该酶家族在调节组蛋白3赖氨酸(H3K)4翻译后的甲基化中起着至关重要的作用〔18〕,而H3K4甲基化程度与白内障〔19〕和糖尿病〔20〕的发生发展均显著相关。有研究对人DC晶状体组织中与miR-204-5p相关的差异表达circRNA进行筛选,发现来源于亲本转录本KMT2E〔染色体7(q22.3)〕外显子4～15的circ KMT2E在DC组织中显著上调,表现出与miR-204-5p相反的表达趋势。此外,生物信息学预测发现circ KMT2E含有四个匹配序列以结合miR-204-5p〔8〕。表明circ KMT2E可能是DC的潜在调节因子,且miR-204-5p结合circ KMT2E的改变可能与DC的发病机制密切相关。本研究结果提示,circ KMT2E的沉默可抑制LEC凋亡,并且circ KMT2E可能与MMP9存在某种关联。

本研究中双荧光素酶报告基因检测结果显示,当转染miR-204-5p mimic进入HLE-B3细胞时,KMT2E-WT的荧光素酶活性被显著抑制。本研究结果表明,circ KMT2E可靶向调控miR-204-5p表达。基于上述证据,可以得出结论,沉默circ KMT2E可通过上调miR-204-5p,抑制MMP9的表达来减少LEC的凋亡。

综上,沉默circ KMT2E可能通过靶向上调miR-204-5p,进而抑制MMP9表达,减少HG诱导的人LEC凋亡。本研究存在一定不足,首先,未对miR-204-5p/MMP9轴进行干预来进一步验证circ KMT2E的作用机制;其次,circ KMT2E是否能调控其他miRNA、基因或通路参与DC中的LEC凋亡,有待进一步研究;最后,circ KMT2E在体内是否能发挥相同作用需要使用动物模型来证实。