申海艳 周静 肖丽娜 马武开 姚血明 陈琳 韩珊

(1贵州省骨科医院骨外科,贵州 贵阳 550001;2贵州中医药大学第二附属医院风湿免疫科;3贵州中医药大学)

膝骨关节炎(KOA),又称膝痹、骨痹,苗医学中称为“冷骨风(冷风湿)”。是因关节软骨退行性改变导致骨质、滑膜增生的一种慢性、进展性、非感染性疾病。中老年发病率较高,发病时多就诊于骨科及风湿免疫科。随着病情进展,严重影响患者日常活动,使患者生活质量下降,成为老年患者致残的主要原因之一。在近年来KOA的治疗中,药物治疗长期疗效并不理想,临床推广受限较多〔1〕。随着传统中医药学的不断发展,中医外治疗法对KOA的治疗逐渐得到了认可。苗医药作为祖国医学的重要组成部分,擅长外治法由来已久。苗医认为“以通为用、以畅为安、壅塞为病、通达为康”;因此,“冷骨风”治疗时主要以“通筋散血”为主。近年来,苗医药在治疗类风湿关节炎、骨关节炎等风湿类疾病中疗效显著,其外治法也在临床得到了广泛应用。苗药五藤膏作为我院外治经验方,前期临床研究已证实治疗KOA有效〔2～5〕。

近年来,越来越多研究表明Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a的异常表达,能特异地激活Wnt/β-连环蛋白(catenin)信号通路,影响软骨化生,从而引起相关靶基因的表达,导致OA的发生〔6～9〕。前期研究〔2～5〕认为Wnt/β-catenin信号通路中的关键因子β-catenin可能对KOA发生发展、软骨组织的病变进程有很大的相关性;因此,本研究在前期研究基础上,为证实苗药五藤膏是否能使Wnt信号参与骨化,调控其通路上游相关基因的表达水平,通过建立KOA模型兔,探讨不同剂量苗药五藤膏干预对KOA模型家兔关节软骨糖原合酶激酶(GSK)-3β蛋白及上游基因Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 2019年3～6月选取同一批4～5月龄健康家兔96只(雌雄各半),体质量1.5～2.5 kg,由贵州中医药大学中心实验室提供,实验动物合格证号:SCXK(黔)2018-0012。适应性喂养1 w后,遵照实验动物伦理要求,将96只家兔随机分为空白组、模型组、巴布膏对照组、苗药五藤膏高剂量组、苗药五藤膏中剂量组、苗药五藤膏低剂量组,每组16只。

1.2实验药物 苗药五藤膏(黑骨藤30 g、大血藤30 g、小花青风藤30 g、香血藤30 g和络石藤30 g打成细粉与凡士林按1∶1的比例混合制成),由贵州中医药大学第二附属医院制剂室提供(黔药制字Z20120072)。使用前均匀将五藤膏涂于纱布上做成贴膏。氟比洛芬巴布膏(日本三笠制药株式社会,规格:40 mg,批号:J20160090)。

1.3主要仪、试剂DYCZ-24DN电泳槽(北京六一仪器厂)、CPA电子天平秤(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、TS-1水平摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)、mμlISKANMK3酶标仪(Thermo)、QuantStudio6实时荧光定量PCR仪(ABI)、电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表有限公司)、袋装吸头(美国Extragene吸头)、AJY-0501纯水仪,艾科浦(Aquapro)、TS8080灰度扫描仪(Canon)、JY02S超微量紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司)、JY300水平电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司);RIPA裂解液(厂家:碧云天,批号:P0013B)二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(厂家:碧云天,批号:P0010)、蛋白marker10-250KD(厂家:海利克思,批号:P12103-2)、兔多抗GSK-3β(45 kD,厂家:LSBio,批号:LS-C458918-100)、兔多抗GAPDH(37 kD,厂家:杭州贤至生物有限公司,批号:AB-P-R 001)、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔二抗(厂家:武汉博士德生物工程有限公司,批号:BA1054)、Trizol(厂家:Ambion,批号:15596-026)、DNA Marker(厂家:TIANGEN,批号:MD114-02)、5×HiScript缓冲液(厂家:VAZYME,批号:R101-01/02)。

1.4构建兔KOA模型 为了减少或避免对家兔膝关节的人为损伤,更好地模拟人KOA的疾病发展,反映中医外治法对兔KOA的治疗作用;采用木瓜蛋白酶关节腔内注射方法制备兔KOA模型〔10〕,即:将4%的木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.3 ml分别于第1、4、7天注入兔右膝关节,第7天注射完毕后,不再进行任何干预(整个造模过程与指导小组成员协助完成)。正常饲养4 w后,通过组织切片观察造模,建立稳定的兔KOA模型。

1.5给药方法 从造模后第5周开始干预治疗,空白组不做任何干预,正常饲养。其余各组患膝均备皮,模型组患膝无菌纱布包扎固定,其余各组分别给予氟比洛芬巴布膏贴敷及不同剂量苗药五藤膏贴敷干预;各治疗组家兔药物使用剂量均为人体等效剂量〔11〕,氟比洛芬巴布膏和苗药五藤膏面积均约为4 cm×3 cm,氟比洛芬巴布膏(约2 g),苗药五藤膏高剂量组(约4 g)、中剂量组(约2 g)、低剂量组(约1 g)。将苗药五藤膏(贵州中医药大学第二附属医院制剂室研制)均匀涂于纱布上做成贴膏,直接敷贴于兔患膝关节面,药物能覆盖患肢膝关节,用绷带包扎固定8 h防止药物挣脱,每日给药一次。给药后第1、2、3、4周各处死4只,在右侧膝关节剥除皮肤取软骨进行各项指标检测。

1.6实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR) 检测Wnt信号上游基因Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA的表达。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参,引物合成由武汉擎科公司完成,NCBI网站进行引物设计、验证,引物序列:Rabbit Wnt3a上游引物 5′-CGCGACCTGGTCTATTACGA-3′、下游5′-TAGCAGCACCAGTGGAAGAC-3′,203 bp;Rabbit Wnt5a上游引物5′-GTCAACAGCCGCTTCAACTC-3′、下游5′-GTCAACAGCCGCTTCAACTC-3′,235 bp;Rabbit Wnt7a上游引物5′-CAAGAAGCCACTGTCGTACC-3′、下游5′-CATTTGACGTAGCAGCACCA-3′,246 bp;GAPDH上游引物5′-TGGCTCTAACAGTCCGCCTAG-3′、下游5′-AGTGCGACGTGGACATCCG-3′,295 bp。提取样本总RNA(Trizol法):取(-80 ℃)冻存软骨组织100 mg,研磨,根据说明书操作,加入Trizol试剂,匀浆静置10 min;再加入氯仿;离心机12 000 r/min离心,可见上-中-下(即:RNA-蛋白-DNA)三相。上层RNA转移至EP管中加入异丙醇,静置后离心,可见白色RNA沉淀;弃上清,加入无RNase的75%乙醇1 ml,重复此步骤一次。弃上清,干燥RNA沉淀,将沉淀溶于20 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。取DEPC水溶解后的RNA测定、计算样本RNA浓度。实时荧光定量PCR检测:将所得到的cDNA做4倍稀释,进行实时荧光定量PCR;采用2-ΔΔCt分析最终目的基因的表达量。

1.7Western印迹检测GSK-3β蛋白表达 按照说明书要求,将称量后将软骨组织块剪碎,液氮研磨后再用钢珠(钢珠直径:0.9～2.0 mm混合)研磨。每组加入裂解液裂〔含2 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)、2 μl磷酸酶抑制剂〕匀浆,然后裂解(冰上),将裂解液离心,取上清移至离心管,将蛋白样品稀释20倍牛血清白蛋白,稀释牛血清白蛋白(BSA)标准品,(按说明书要求,单位:mg/ml)。将蛋白样品(经PBS稀释20倍)、标准蛋白按组依次加入96孔板内,BCA试剂盒按50∶1混合后加入96孔板内。温箱孵育后酶标仪测吸光值(OD)值(OD568)。算出样品蛋白浓度。扫膜曝光,最后BandScan分析灰度值。

1.8病理观察 患膝软骨取材后,由专人将所取病理组织用中性甲醛固定、脱钙、透蜡包埋等处理,苏木素-伊红(HE)染色,病理变化参考改良版Mankin〔12〕评分对患膝关节软骨造模情况进行分析、评分。

1.9统计学方法 采用SPSS24.0软件进行方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组关节软骨病理改变比较 经过4 w干预后,空白组关节面软骨无退变,关节软骨细胞分布均匀,无变性、萎缩等;模型组患膝关节面软骨重度退性改变,软骨细胞分布紊乱,重度变性、萎缩;巴布膏对照组关节面软骨轻度退性改变,软骨细胞分布轻度紊乱,轻度变性、萎缩;苗药五藤膏低、中、高剂量组退变程度与剂量呈正相关。见图1。

图1 各组关节软骨病理(×200)

2.2各组Mankin评分比较 空白组改良版Mankin评分明显低于模型组、巴布膏对照组及苗药五藤膏低、中、高剂量组(P<0.05),苗药五藤膏低、中、高剂量组及巴布膏对照组改良版Mankin评分均明显低于模型组(P<0.05);苗药五藤膏低、中、高剂量组组内病理改良版Mankin评分比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组兔膝关节软骨组织病理改良版Mankin评分、GSK-3β蛋白表达比较

2.3各组GSK-3β蛋白表达比较 与空白组比较,模型组、苗药五藤膏低、中、高剂量组、巴布膏对照组兔膝关节软骨组织GSK-3β蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组相比,苗药五藤膏低、中、高剂量组、巴布膏对照组GSK-3β蛋白表达均明显降低(P<0.05,P<0.01)。见表1、图2。

1～6:空白组、模型组、苗药五藤膏低剂量、苗药五藤膏中剂量、苗药五藤膏高剂量、巴布膏对照组图2 各组干预4 w后软骨组织中GSK-3β蛋白表达

2.4各组Wnt3a mRNA表达水平比较 与空白组相比,给药后1、2、3、4 w模型组、苗药五藤膏中、低剂量组、给药后4 w苗药五藤膏高剂量组Wnt3a mRNA明显升高(P<0.05);与模型组比较,苗药五藤膏低、中、高剂量组、巴布膏对照组Wnt3a mRNA明显降低(P<0.01);与巴布膏对照组相比,苗药五藤膏低剂量Wnt3a mRNA明显升高(P<0.01);与苗药五藤膏低剂量组比较,苗药五滕膏中、高剂量组Wnt3a mRNA明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组不同时间点Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA表达水平比较

2.5各组Wnt5a mRNA表达水平比较 与空白组相比,给药后1、2、3、4 w模型组、苗药五藤膏高、中、低剂量组、给药后1 w苗药五藤膏高剂量组、巴布膏对照组Wnt5a mRNA明显升高(P<0.05);与模型组相比,巴布膏对照组及苗药五藤膏高、中、低剂量组Wnt5a mRNA明显降低(P<0.01);苗药五藤膏低剂量与中剂量组比较均有统计学差异(P<0.05)。见表2。

2.6各组Wnt7a mRNA表达水平比较 与空白组相比,给药后1、2、3、4 w模型组、苗药五藤膏中、低剂量组Wnt7a mRNA表达明显升高(P<0.01);与模型组相比,巴布膏对照组、苗药五藤膏高、中、低剂量组Wnt7a mRNA表达明显降低(P<0.01);与巴布膏对照组比较,苗药五藤膏低剂量组Wnt7a mRNA表达明显升高(P<0.01);与苗药五藤膏低剂量组比较,苗药五藤膏中、高剂量组Wnt7a mRNA表达明显降低(P<0.05)。见表2。

3 讨 论

目前与骨关节炎发生发展有密切关系的4条主要信号通路中,Wnt/β-catenin信号通路最为重要,其在KOA软骨细胞的分化、增殖和凋亡中发挥重要作用,信号通路的异常导致骨骼系统代谢失衡,最终导致KOA的形成〔13～15〕。Wnt来源于对果蝇的无翅基因与小鼠Int-1基因的研究,由许多富含半胱氨酸的小型分泌蛋白组成〔16〕。 Wnt/β-catenin 信号通路是Wnt蛋白激活的4条信号通路中最经典的一条信号通路。Wnt/β-catenin 信号通路主要调节软骨细胞的增殖、分化以维持关节完整性,是调节软骨代谢的重要途径。KOA的发生发展与Wnt信号通路的异常有着密切联系,有研究表明,GSK-3β对Wnt通路有一定的调节作用,可使软骨骨化的进程减缓,延缓病情恶化〔17〕。在RNA表达层面,β-catenin信号通路参与KOA模型大鼠滑膜炎症反应,在其下游炎症因子IL-1β的表达中及KOA退变中均可能发挥重要调控作用〔18〕。Wnt信号中任何组成分子出现异常,都会导致此信号异常活化,通路中配体、转录因子、受体等表达异常均会加速 KOA的形成与发展〔19〕。

Wnt家族蛋白中Wnt3a、Wnt5a和Wnt7a等已被证实参与β-catenin信号通路上游基因的激活〔20～22〕。Wnt3a可通过激活下游β-catenin抑制软骨细胞形成。有研究表明,骨关节炎患者在间充质干细胞(MSCs)及间充质祖细胞(MPCs)中,Wnt3a明显抑制了MSCs向成骨细胞分化的相关因子表达,减少成骨钙化形成〔23〕;Wnt3a表达增高时,MPCs中Wnt/β-catenin通路被激活时,β-catenin在细胞中表达也随之增多〔24〕。软骨化生期,Wnt5a与Wnt5b加速软骨小体形成、化生,对维持软骨细胞的增长起着关键的作用;而Wnt5a与Wnt5b在软骨成熟分化期的异常表达,反而会抑制其增殖、分化〔25〕,已有研究显示Wnt5a在骨关节炎中的表达与关节软骨的退变程度呈正相关〔26〕。另一方面,Wnt7a在骨骼形成、发生及发育中起重要作用,Wnt7a可通过β-catenin来抑制软骨内MSCs,影响软骨细胞发育,Wnt7a拮抗剂可抑制Wnt7a在软骨细胞中的表达〔27,28〕。Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a均为激活Wnt/β-catenin信号通路的配体蛋白,如果能通过相应的中医药外治干预,阻止或减少其信号的激发,则可能阻断或延缓KOA的疾病进展。

本研究结果说明,Wnt/β-catenin信号通路GSK-3β蛋白与上游基因Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a与KOA的发生发展有着密切联系,且其表达量与疾病进程有很大的相关性,通过本实验研究结果进一步证明了Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA与GSK-3β蛋白表达与KOA关节软骨退变程度及疾病进展有一定的正相关性。