孙红娟,蒋经伟,董 颖,高 杉,关晓燕,陈 仲,王 摆,潘泳嘉,肖 瑶,姜萍哲,李佩佩,张宸瑜,周遵春

( 辽宁省海洋水产科学研究院,辽宁省海洋水产分子生物学重点试验室,辽宁 大连 116023 )

胸腺素是具有生物活性的多肽,是从小牛胸腺中提取出来的,按照等电点(PI)分为α(PI<5)、β(57)亚型[1]。该家族从低等棘皮动物到高等脊椎动物均为高度保守的,但是在细菌和其他微生物中尚未发现[2]。β-胸腺素家族分子质量约5 ku,由40～44个氨基酸组成,在生物体内的表达具有物种特异性。β-胸腺素能够调节肌动蛋白浓度,参与细胞骨架重排以及细胞的分化、迁移等细胞活动[3-4]。另外β-胸腺素作为抗菌肽,也具有抗菌和抗病毒等方面的活性。

仿刺参(Apostichopusjaponicus)属棘皮动物门海参纲仿刺参属,因其缺乏适应性免疫系统,只能依靠先天性免疫系统抵御外界病原刺激[5]。抗菌肽在先天性免疫系统中发挥着至关重要的作用。胸腺素作为抗菌肽家族中的一员,在仿刺参中的作用机制尚无研究报道。研究仿刺参β-胸腺素的结构特征以及在病原菌刺激后是否参与机体的免疫应答,将为仿刺参活性多肽的研究提供材料,同时为仿刺参养殖过程中的病害防控以及生态调控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 组织和发育样品

试验用仿刺参取自辽宁省海洋水产科学研究院引育种中心,体质量(6.0±1.5) g,养殖水温16～18 ℃,盐度29,pH 8.3～8.5。试验共取6种组织,包括体壁、肌肉、管足、呼吸树、肠道和体腔细胞。不同发育时期包括受精卵、囊胚、原肠胚、小耳幼体、中耳幼体、大耳幼体、樽型幼体、五触手幼体和稚参。

1.1.2 免疫菌株

免疫刺激试验采用从仿刺参腐皮综合征病灶处分离出来的4种病原菌:希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonasnigrifacien)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)和灿烂弧菌(Vibriosplendidus)。4种病原菌均在2216E培养基中,于28 ℃,150 r/min条件下培养。当密度达到108cfu/mL时,可用于免疫刺激。

1.2 试验方法

1.2.1 基因全长克隆

用动物组织RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取仿刺参体腔细胞RNA,以前期转录组测序得到的部分仿刺参β-胸腺素序列为基础,采用SMARTer 5′/3′RACE试剂盒(Clontech)对该基因5′端进行克隆,3′端的克隆采用3′-Full Race PrimeScripTMRTase试剂盒(Takara),RACE特异引物(GSP)见表1。反应体系见表2。

表2 仿刺参β-Thymosin的RACE PCR反应体系Tab.2 RACE PCR system of Ajβ-thymosin

1.2.2 生物信息学分析

在美国国家生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)进行开放阅读框的预测和保守结构域分析;采用Expert Protein Analysis Systerm(http://www.expasy.org/tools/)进行核酸和氨基酸序列的翻译;在SMART平台(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行蛋白二级结构预测。采用MEGA 4.0软件对不同物种氨基酸序列进行比对后构建系统发育进化树,自展值设置为1000次重复。

1.2.3 仿刺参免疫

将同一批次的300头健康仿刺参平均分为5组:对照组与4个免疫刺激组。试验采用灭菌注射器对仿刺参进行体腔注射,对照组注射灭菌海水,刺激组分别注射不同的菌液。试验采用的注射剂量均为100 μL/头[6]。每组在注射后4、24、48、72 h和96 h分别选取9头仿刺参解剖并获取体腔液,随机分成3份,每3头混合成1份,4 ℃,3000 r/min(离心半径10 cm)离心10 min,弃上清液收集体腔细胞保存用于RNA提取。

1.2.4 荧光定量试验

使用PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒对总RNA进行反转录。反转录后获得cDNA样品。使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒进行实时荧光定量PCR,以 Cytb作为内参基因(表1)[7]。反应体系为:0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ(50×),1 μL cDNA 模板,10 μL TB Green Premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) (2×Conc.),正、反引物各0.8 μL,7 μL dH2O。每个样本重复3次。采用 2-ΔΔCt法对实时荧光定量PCR所获取的Ct值进行分析。不同组之间表达差异水平采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析和邓肯多重比较,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 仿刺参β-胸腺素基因结构分析

根据仿刺参β-胸腺素已知的部分序列,设计3′和5′末端引物(表1),采用RACE法进行克隆,将得到的3′和5′末端序列和已知序列进行拼接,获得仿刺参β-胸腺素的mRNA全长1877 bp,命名为Ajβ-Thymosin。序列提交至美国国家生物技术信息中心数据库,获得登录号:MF989226。开放阅读框(ORF)长126 bp,翻译后氨基酸序列为41个,分子量为4.6 ku,理论等电点为5.25,结构分析发现存在保守的β-胸腺素肌动蛋白结合基序(THY),不存在跨膜结构(图1)。

图1 仿刺参β-胸腺素的序列(a)和结构(b、c)分析Fig.1 Sequence (a) and structure (b, c) analyses of Ajβ-thymosina.灰色标记部分为开放阅读框,黄色标记部分为G-actin 结合结构域,红色氨基酸序列为保守功能区; b、c分别为功能结构域和二级结构.a.the ORF and G-actin binding residues are highlighted in grey and yellow, respectively; the red amino acid sequence is conservative functional residues; b and c. the functional structure and secondary structure, respectively.

2.2 仿刺参β-胸腺素蛋白序列的进化分析

将Ajβ-Thymosin基因的氨基酸序列和其他物种的氨基酸序列(表3)进行比对分析发现,在仿刺参β-胸腺素中存在着保守的功能序列EVASFDKSKLK(9-19)[8]和保守的G-actin 结合结构域LKKTET[9](图1)。系统进化分析显示Ajβ-Thymosin基因和紫色球海胆(Strongylocentrotuspurpuratus)、海绵和九孔鲍的β-胸腺素聚为一支(图2)。

图2 仿刺参β-胸腺素的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of Ajβ-thymosin

表3 不同物种β-胸腺素的氨基酸序列Tab.3 The amino acid sequence of β-thymosin from different species

2.3 仿刺参β-胸腺素在不同组织和不同发育时期的表达模式

实时荧光定量PCR测得Ajβ-Thymosin基因在不同组织的表达结果见图3。Ajβ-Thymosin基因在体腔细胞和呼吸树中高表达,并且与肠道、管足、肌肉和体壁组织中的表达量存在显著差异。β-胸腺素在仿刺参不同发育时期的表达结果见图4。Ajβ-Thymosin基因在受精卵期、原肠胚期和囊胚期低表达,从小耳幼体期开始显著上调,并且在稚参期Ajβ-Thymosin基因的表达量达到最高。

图3 β-胸腺素基因在仿刺参不同组织中的表达模式Fig.3 Expression level of Ajβ-thymosin at different tissues in sea cucumber A. japonicus

图4 β-胸腺素基因在仿刺参不同发育时期的表达模式Fig.4 Expression level of Ajβ-thymosin at different developmental stages in sea cucumber A. japonicus

2.4 不同病原菌刺激后仿刺参β-胸腺素基因的表达变化

采用4种病原菌对仿刺参进行免疫刺激,检测体腔细胞中Ajβ-Thymosin基因在刺激后4、12、24、48、72、96 h的表达变化情况(图5)。对照组注射灭菌海水,在注射后6个时间点也同时取样。在蜡样芽孢杆菌组中,Ajβ-Thymosin基因在4 h表达水平显著下调,在12 h表达水平显著上调并达到最高水平,随后在24、48 h表达水平下调,在72 h表达水平小幅度上调后在96 h表达水平又下调(图5a)。在希瓦氏菌组中,Ajβ-Thymosin基因在4 h表达水平也出现显著下调,从12 h开始表达水平开始上调,在48 h表达水平达到最高,随后在72 h表达水平开始下调,96 h表达水平显著下调(图5b)。在假交替单胞菌组中,Ajβ-Thymosin基因在注射后4、12 h表达水平下调,至24 h表达水平上调并达到峰值,48 h表达水平上调但是上调不显著,在72、96 h表达水平均下调(图5c)。在灿烂弧菌组中,Ajβ-Thymosin基因在4、12、24 h均下调,48 h表达水平显著上调达到最高,随即在72、96 h表达水平均下调(图5d)。

3 讨 论

抗菌肽具有广谱抗菌作用,在非特异性免疫系统中占据着重要位置。在海参抗菌肽研究方面,Beauregard等[10]从冰岛刺参(Cucumariafrondosa)体腔液中分离出一种可以抑制绿脓杆菌(Pseudomonasaruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生长的抗菌肽。王明昌[11]从仿刺参消化道内分离出一种显著抑制蛭弧菌的抗菌肽。笔者克隆了一种仿刺参抗菌肽Ajβ-Thymosin基因,通过序列结构、组织、发育和免疫表达分析,探索Ajβ-Thymosin基因是否具有免疫活性并且参与机体的免疫应答反应。

3.1 仿刺参β-胸腺素基因的序列特征

胸腺素广泛地存在于脊椎动物和无脊椎动物中,目前发现至少存在15种β-胸腺素[12]。笔者在仿刺参中克隆得到了Ajβ-Thymosin基因,氨基酸序列为41个,分子质量为4.6 ku,等电点为5.25,具有高度保守的G-actin结合序列LKKTET[9],这些特征均表明Ajβ-Thymosin基因属于β-胸腺素家族的成员。通过进化分析发现,仿刺参β-胸腺素和紫色球海胆、海绵和九孔鲍的β-胸腺素聚为一支。海胆(Paracentrotuslividus)中的β-胸腺素能够和G-actin结合并参与机体抗菌免疫反应[8]。仿刺参和海胆β-胸腺素都有相同的保守功能结构域EVASFDKSKLK(9-19)[8],因此推测Ajβ-Thymosin基因中也具有免疫功能。

3.2 仿刺参β-胸腺素基因的功能分析

在仿刺参不同发育时期,免疫系统也处在一个动态发育的过程。Ajβ-Thymosin基因的表达量从小耳幼体期开始表达上调。小耳幼体期是仿刺参胚胎发育结束幼体发育的开始,此时消化道开始分化,免疫系统也开始形成,表明Ajβ-Thymosin基因在机体发育过程中起到关键作用。

β-胸腺素在不同物种体内具有组织表达特异性,在仿刺参体腔细胞中表达最高。这与β-胸腺素在斑节对虾(Penaeusmonodon)[13]、合浦珠母贝(Pinctadafucata)[14]、皱纹盘鲍(H.discusdiscus)[15]、九孔鲍[16]、中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)[17]中的组织分布研究结果相似。由于体腔细胞、血淋巴细胞和血细胞在无脊椎动物中发挥免疫作用[13],因此推测Ajβ-Thymosin基因具有免疫活性。

β-胸腺素具有抗菌和抗病毒活性,许多研究发现病原体能够引起β-胸腺素上调表达。在斑节对虾[13]、日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)[18]、克氏原螯虾(Procambarusclarkii)[19]、长牡蛎(Crassostreagigas)[20]、皱纹盘鲍[15]、九孔鲍[16]、中华绒螯蟹[17]和卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)[21]面对细菌、病毒或免疫刺激剂刺激时,β-胸腺素的相对表达量出现了不同程度上升。仿刺参受到4种不同病原菌刺激后,Ajβ-Thymosin基因的表达量在4 h均发生下调。有研究显示,仿刺参体内9个免疫相关基因在病原菌刺激后4 h的表达水平也均发生了下调[22-23],这表明仿刺参免疫系统中一些免疫因子在病原入侵初期会受到抑制。在蜡样芽孢杆菌和希瓦氏菌组,Ajβ-Thymosin基因的表达量在12 h开始上调。在假交替单胞菌组,Ajβ-Thymosin基因的表达量在24 h开始上调。在灿烂弧菌组,Ajβ-Thymosin基因的表达量在48 h开始上调。Ajβ-Thymosin基因开始上调表达的时间不同可能是由不同细菌的细胞毒性不同造成的。Ajβ-Thymosin基因的动态表达模式表明其参与了仿刺参体腔细胞免疫应答的过程。

4 结 论

β-胸腺素作为一种抗菌肽,具有广谱抗菌活性。Ajβ-Thymosin基因具有β-胸腺素家族成员特有并且高度保守的结构域,参与了仿刺参机体发育和免疫防御过程,这将为新型抗菌肽研究和病害防控提供理论支持。