张光晨,王 洋,2,孙学亮,2,罗云龙,王竞儒,刘凡湘,季延滨,2

( 1.天津农学院 水产学院,天津 300392; 2.天津市水产生态及养殖重点实验室,天津 300392 )

《2020中国渔业统计年鉴》[1]显示,2019年我国淡水养殖总产量超3.0×107t,如此高的产量,高密度养殖模式功不可没[2]。但高密度养殖面临着水质劣化挑战[3],如富营养化引发水华,底栖生物多样性降低,鱼类细菌和寄生虫病频发,危害养殖动物的健康。同时养殖排放的氨氮、亚硝态氮、硝态氮、磷等,导致水质恶化[4]。为保证养殖鱼类的健康以及绿色养殖的可持续性,必须进行养殖尾水的净化。传统净化水质的方法有固化、蒸发、反渗透、化学处理等[5],但这些方法价格昂贵、易造成二次污染。生物修复法是一种利用生物的自然生物学机制净化水质的方法,具有经济、环保、持续有效的特点。植物可吸收水体中的氮、磷[6];微生物可降解有机物[7],也可作为水产动物饵料,影响养殖动物肠道菌群[8]、生理、消化免疫系统[9]等。近年来,研究人员通过高通量测序技术揭示了多种水产动物养殖环境的微生物结构及变化规律[10-15],以探求不同环境微生物参与养殖水质调控的作用机制,发现不同生境的微生物构成的差异[2,16-18]。同时发现,微生物的丰度也会受环境因子的影响[5]。

大口黑鲈(Micropterussalmoides)是我国普遍养殖的鱼类之一,其高密度养殖模式存在水质劣化问题。生态养殖模式可有效改善大口黑鲈养殖水质,如:黄鹤忠等[19]采用网隔技术构建的大口黑鲈-河蚌-菱、藕、虾生态养殖系统,显著降低了水体中氨氮和亚硝态氮含量,并提高了水体透明度及溶解氧含量,并提高了鱼体抗病能力,促进其生长的效果;王海华等[20]构建的大口黑鲈-野杂鱼-食碎屑动物-无脊椎动物-水生植物生态系统,年固定碳、氮、磷量分别为7.08、1.18、0.57 t,减轻了湖水富营养化程度;刘梅等[21]设计的大口黑鲈-鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)-水生植物-浮游动植物养殖模式的相对和绝对磷利用率均显著高于传统养殖池塘。微生物作为生态养殖中重要的净水单元,对氮、磷循环有重要影响[7]。然而目前关于微生物的水质调控作用的研究多聚焦于单个或少数益生菌的分析,宏观微生物组与理化指标的相关性尚未完全阐明。探明大口黑鲈生态养殖模式中微生物宏观群落结构及其与水体理化因子的相关性,有利于进一步提高大口黑鲈生态养殖模式的净水效率。

笔者监测天津某大口黑鲈生态塘7—9月养殖区与毛刷微生态区微生物多样性以及水理化指标的变化情况,并分析同一区域水理化指标与微生物间的关联性,以期为大口黑鲈生态塘7—9月水质理化因子和微生物结构的调控、生物修复法中有益菌的筛选,及后续深入解析生态养殖模式中的水质指标与水体微生物的变化机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 养殖池塘

天津武清区海乐水产养殖有限公司的大口黑鲈生态养殖池塘,养殖区域300 m2,配套生态水处理过滤区域100 m2(图1)。养殖尾水通过水生蔬菜处理后,表层水进入以毛刷为基质的微生态过滤区域,之后底层水进入下一个水生蔬菜处理区,处理后进入养殖池塘循环利用。在300 m2的养殖区域内,大口黑鲈初始放养4000尾。

图1 大口黑鲈生态养殖池塘示意Fig.1 System diagram of an ecological culture pond for largemouth bass M. salmoides

1.2 样本采集

在大口黑鲈快速生长期,即2019年7月17日、8月6日、9月6日的10:00—12:00,分别收集大口黑鲈生态养殖池塘表层水(0～10 cm),养殖池塘的底泥和微生态区用于附着微生物的毛刷。每个采样点采集3个样本,均匀混合后作为1个样本,按照样本系列和采集时间命名。底泥样本:HLID717、HLID806、HLID906;毛刷样本:HLIM717、HLIM806、HLIM906;水样:HLIS717、HLIS806、HLIS906。其中水样首先采用双层纱布滤除杂质,随后分别采用0.45 μm和0.22 μm滤膜抽滤,以无菌生理盐水洗涤滤膜,离心收集水中的细菌。毛刷为随机剪取的刷毛片段。以上样本处理完毕后立即于-80 ℃冻存,并尽快送至测序公司,用于微生物多样性分析。同时在养殖池塘的3个位置取表层水样(40～50 cm),抽滤去除杂质后混合冷藏,用于理化指标测定。

1.3 养殖池塘水质理化指标

采用过硫酸钾氧化-紫外分光光度法测总氮[22]、酸性高锰酸钾法测高锰酸盐指数[23]、纳氏试剂法测氨氮[24]、N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测亚硝态氮[25]、酚二磺酸分光光度法测硝态氮[26]、过硫酸钾-钼酸铵分光光度法测总磷[27]、钼酸铵分光光度法测磷酸盐[27]、pH计法测pH[28]、103～105 ℃烘干法测固体悬浮物[29]、酸碱指示剂滴定法测总碱度[30]、EDTA滴定法测硬度[31]、精密盐度计测盐度。每个样品测定3个平行数据,结果以平均值±标准差表示。

1.4 微生物多样性测定

采用E.Z.N.A.®soil DNA试剂盒(美国奥美嘉生物技术公司)提取样本总 DNA,使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量,使用NanoDrop 2000测定DNA浓度和纯度;采用338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 对 16S rRNA基因V3～V4可变区进行 PCR 扩增。利用因美纳的Miseq PE300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。使用fastp软件对原始测序序列进行质控,使用FLASH软件进行拼接。拼接序列采用UPARSE 软件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/),根据97%的相似度对序列进行运算分类单元聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier (http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)对每条序列进行物种分类注释,比对SILVA数据库(Release132 http://www.arb-silva.de),设置比对阈值为70%。

1.5 数据处理

利用SPSS 24软件对理化指标数据进行方差分析。并通过ORIGIN 2018软件对理化指标数据进行处理,绘制散点图。微生物多样性采用美吉生物云平台分析处理和绘图。热图由Adobe Acrobat软件整理绘制。

2 结 果

2.1 高通量测序基础数据和物种维恩图

大口黑鲈养殖池塘的水、底泥和毛刷样本经过高通量测序,共测得有效序列470 035条,有效碱基数195 452 334个,与数据库比对注释到54门134纲365目649科1338属2776种。

各样本的运算分类单元集合情况见图2。全部样本共有运算分类单元 67个,各月底泥样本微生物运算分类单元数均最多,而水样运算分类单元数最少。同一样本各月运算分类单元数不同,底泥在8月,毛刷和水样在7月时运算分类单元总数和独有数较高。

图2 大口黑鲈养殖池塘各样本微生物运算分类单元维恩图Fig.2 Venn diagram of OTUs in samples from Largemouth bass M. salmoides culture pond

2.2 大口黑鲈池塘微生物α多样性

大口黑鲈生态池塘各样本的微生物α多样性见图3。香农指数越大,辛普森指数越小,群落多样性越高;Ace指数和Chao指数越高,群落组成越丰富。与毛刷和水样相比,各月底泥的微生物多样性和丰富度均更高,其中8月底泥的α多样性最高;毛刷的微生物α多样性在7—9月各不相同,其多样性(香农指数和辛普森指数)在7月和9月低于水样,丰富度(Ace指数和Chao指数)在7和8月高于水样;各月水样的微生物丰富度和多样性均不高,且变化幅度较小。

图3 大口黑鲈池塘微生物α多样性Fig.3 Alpha diversity of metrics in different samples

2.3 大口黑鲈养殖池塘微生物群落组成变化

大口黑鲈池塘各样本的微生物群落组成见图4。不同种类和取样时间样本的微生物组成有所不同。变形菌门是各样本共有的优势物种(相对丰度>8%)(图4a)。底泥各月的优势微生物变化较小,门水平上主要为变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和绿弯菌门。水样中存在大量的蓝细菌门微生物,且其所占比例呈上升趋势,7月为10.13%,8月为32.40%,9月上升为最优势菌门(35.62%)。7—9月毛刷的微生物组成差别较大,7月以绿弯菌门为最优势门,8月变形菌门在微生物群落中所占比例最高,9月厚壁菌门则成为绝对优势微生物(73.60%)。从毛刷样本属水平的微生物群落组成可知,9月优势物种动性球菌属(Planococcus,39.87%)和微小杆菌属(Exiguobacterium,25.27%)(图4b)均属于厚壁菌门。

图4 各样本的微生物组成Fig.4 Microbial composition in the samples

2.4 大口黑鲈池塘微生物的主成分分析

各样本主成分的异同见图5。主成分1特征值的贡献率为47.01%,主成分2特征值的贡献率为27.53%,两者之和为74.54%,说明这2个主成分可代表大口黑鲈池塘微生物多样性。各月份底泥样本微生物主成分相似度很高,表明底泥微生物组成较为恒定;各月份水样的主成分1相近,主成分2有一定差别;而各月份毛刷样本的主成分1和主成分2均相差很大,表明毛刷微生物在7—9月变化较大。

图5 各样本的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of the samples

2.5 大口黑鲈养殖池塘水理化指标的变化

大口黑鲈养殖池塘微生态区水理化指标见表1。7—9月,水体氨氮质量浓度先升后降,最高值为8月的(0.99±0.02) mg/L;亚硝态氮、总磷质量浓度则先降后升,最高值分别为9月的(0.24±0.01) mg/L和7月的(4.15±1.32) mg/L;硝态氮含量逐渐升高,最高值为(4.12±0.01) mg/L。与8月相比,9月水样的总氮、正磷酸盐、固体悬浮物质量浓度、高锰酸盐指数、pH和总碱度显著升高(P<0.05),而硬度和盐度显著下降(P<0.05)。

表1 大口黑鲈生态养殖池塘微生态区7—9月水体理化指标Tab.1 Physical-chemical properties of aquatic water in microecological zone of ecological pond for largemouth bass M. salmoides from July to September

大口黑鲈生态养殖池塘养殖区的水理化指标见表2。7—9月,亚硝态氮和硝态氮质量浓度逐渐上升,最高值分别为(0.33±0.01) mg/L和(4.03±0.01) mg/L;总磷质量浓度先降后升,最高值为7月的(5.12±0.24) mg/L;氨氮质量浓度先升后降,最大值为8月的(1.56±0.03) mg/L。与8月相比,9月的总氮、正磷酸盐、固体悬浮物质量浓度、高锰酸盐指数、pH、总碱度以及硬度均显著上升(P<0.05)。

表2 大口黑鲈生态养殖池塘养殖区7—9月水理化指标Tab.2 Physical-chemical properties of aquatic water in farming area of ecological pond for largemouth bass M. salmoides from July to September

2.6 大口黑鲈养殖池塘微生物和水体理化指标的相关性

2.6.1 大口黑鲈养殖区微生物和水体理化指标相关性

大口黑鲈养殖区水体理化指标与养殖区池塘水和底泥中主要微生物丰度的相关性见图6。水温与伯克氏菌科呈显著正相关(P<0.05), 总磷与水体中鱼孢菌科存在极显著正相关(P<0.001), 与荧光杆菌科、微杆菌科、根瘤菌科、圆杆菌科显著正相关(P<0.05)(图6a);总磷与底泥中 Family_XII_o__Clostridiales极显著正相关(P<0.01),亚硝态氮与底泥红杆菌科丰度呈显著负相关(P<0.05)(图6b)。

图6 养殖区水体(a)、底泥(b)以及微生态区毛刷(c)微生物与相应水体理化因子的皮尔逊相关性Fig.6 Correlation between microorganisms in aquaculture water (a), sediment (b) and brush in microecology zone (c) with their corresponding aquatic water physical-chemical factors“*”代表显著相关(P<0.05),“**”和“***”代表极显著相关(P<0.01和P<0.001).“*” in the figure represent significant correlation (P<0.05), “**” and “***” represent significant correlation (P<0.01 and P<0.001).

2.6.2 毛刷微生物和微生态区水体理化指标相关性

毛刷的微生物与微生态区水体理化指标相关性见图6c。水温与Norank_o__Chloroplast显著负相关,与Blastocatellaceae显著正相关(P<0.05);Norank_o__norank_c__Nitrospira与亚硝态氮、根瘤菌科和硝态氮均显著负相关(P<0.05);而氨氮与Norank_o__norank_c__Subgroup_6极显著正相关(P<0.01),与Rubritaleaceae显著正相关(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 7—9月大口黑鲈生态养殖池塘微生物多样性的变化

3.2 7—9月大口黑鲈池塘微生物组成的异同

本试验结果表明,大口黑鲈养殖池塘各部位微生物组成有一定的相似性,底泥、池塘水和毛刷中共有优势微生物为变形菌门,水环境中的各月份共有优势微生物为变形菌门、蓝细菌门、拟杆菌门。其中变形菌门占优势与其他大口黑鲈池塘微生物的报道一致,但是其他次优势门却不相同。Zheng等[16]研究的大口黑鲈池塘水门水平的优势种依次为变形菌门、放线菌门和拟杆菌门;刘梅等[17]报道的池塘内循环流水养殖模式下水样优势微生物依次为变形菌门和放线菌门;王朋等[18]研究报道大口黑鲈工程化循环水养殖中7—11月门水平的丰度前4的微生物门类分别为变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和蓝细菌门,属水平优势菌为假单胞菌、黄杆菌和聚球菌属。已有研究显示,变形菌门在不同水产动物的养殖池塘中广泛存在,且通常为最优势微生物群类, 而其他优势微生物则随养殖品种不同存在较大差异[35-37]。变形菌门有降解污染物[38]、修复污染土壤[37]等作用,对于养殖环境微生态平衡有重要意义。

试验结果显示,大口黑鲈养殖池塘各部位微生物组成在7月、8月和9月有差异。9月毛刷样本中的厚壁菌门丰度较7月和8月有大幅度增加,主要是微小杆菌属和动性杆菌属微生物比例增加。微小杆菌属具有分解有机污染物、缓解重金属污染和改善水质等功能[35],但也可促进蓝藻的生长[39]。本试验结果显示,大口黑鲈养殖池塘水中8月和9月的蓝细菌门比例较高,同时水体各月的总氮质量浓度大于0.2 mg/L、总磷质量浓度大于0.02 mg/L,表明水体富营养化[40]。因此大口黑鲈在养殖到8月和9月时,应注意监控池塘水质和藻相变化,控制池塘内蓝藻的生长。

3.3 7—9月大口黑鲈池塘水理化因子变化及其与微生物组成的相关性关系

本试验中各月份大口黑鲈养殖池塘水体理化指标随养殖的月份改变而改变。总磷、亚硝态氮、硝态氮、氨氮、水温等是被广泛使用的水质理化参数,综合地影响着水质[41]。7—9月水体总磷含量的显著降低与硝态氮的显著升高,可知水体的水质状态可能发生了改变。水体中营养物质的富集会导致藻类或水生植物加速生长,造成水华,并污染水质[42]。而硝态氮则是氮循环的主要产物之一[43],一般硝态氮没有危害,但在过量时,在厌氧条件下会生成对生物体有害的亚硝态氮,亚硝态氮含量的升高直接威胁着水生动物的生存[44]。所以在7—9月的大口黑鲈生态养殖中调控水体氮、磷水平非常重要。

从大口黑鲈生态养殖池塘微生物组成及理化因子相关性可知,该生态养殖池塘微生物与水体理化因子有关。这与罗金飞等[45-46]所报道的微生物群落的组成与养殖水体理化因子有密切关系观点相同。本试验结果表明,Norank_o__norank_c__Nitrospira和红杆菌科的相对丰度与养殖区水体亚硝态氮含量呈显著负相关(P<0.05)。Norank_o__norank_c__Nitrospira是一类常见的硝化细菌,常被用作微生态制剂,其主要作用是参与硝化作用的第二步,将环境中的亚硝态氮转化为硝态氮[47]。红杆菌科的菌株LZB033的代谢产物二甲基磺酰丙酸(DSMP)可使硝态氮转化为氮气[48]。可见Norank_o__norank_c__Nitrospira与红杆菌科微生物可能在大口黑鲈生态池塘中发挥降亚硝态氮的积极作用。笔者还发现,根瘤菌科与硝态氮显著负相关(P<0.05)。而Jia等[49]发现,根瘤菌科与水体硝态氮正相关,认为根瘤菌科不同属的细菌功能可能完全相反,有些具有硝化功能,有些具有反硝化功能。进一步分析池塘微生态系统功能基因的组成,更有利于深入解析养殖池塘中微生物构成与理化因子的关联性。

笔者仅在8月和9月的一个时间点进行了部分理化指标的取样测量,如开展长时间连续性的监测将更有利于反映水质的动态变化情况。另外笔者仅对微生物与理化因子的相关性进行了初步分析,无法确定二者之间的因果关系。若后续开展机理研究,将有助于揭示特定微生物在大口黑鲈生态养殖池塘中的作用,并为微生态环境的评估以及水质调节型益生菌资源的开发提供依据。

4 结 论

采用16S rRNA基因高通量测序法研究发现,7—9月大口黑鲈生态养殖池塘微生物组成和水体理化指标随月份发生变化。微生态区水体中硝态氮含量与毛刷中的根瘤菌科丰度显著负相关;生态区和养殖区亚硝态氮含量分别与毛刷中的Norank_o__norank_c__Nitrospira和底泥中的红杆菌科丰度显著负相关。研究结果提示,红杆菌科、Norank_o__norank_c__Nitrospira和根瘤菌科细菌有作为大口黑鲈生态养殖水体中亚硝态氮、硝态氮含量指示或者调节功能菌的潜力。本试验结果初步解释了微生物组成与水体理化指标的关联性,可为今后大口黑鲈生态养殖池塘7—9月水质理化因子调控、生物修复法改善水质,及后续探究更深层次的生态养殖模式中水质理化指标与水体微生物的变化机制提供参考,从而实现大口黑鲈水质的生态化调控。