朱经纬,罗艾虎,张天翼,宋文瑄,董羽吉,彭方

(湖北大学资源环境学院,区域开发与环境响应湖北省重点实验室,湖北 武汉 430062)

0 引言

2, 4-二氯苯酚(2, 4-dichlorophenol)主要用作农药、医药中间体[1].由于2, 4-二氯苯酚是一种原生质的高毒物质,美国环保署(EPA)将其列为优先控制污染物[2].含二氯酚废水如果未经处理排放会污染周边场地土壤、水体、底泥等环境介质,并对人体健康构成威胁[3-4].因而去除环境中 2, 4-二氯苯酚的污染物研究受到了众多学者的关注[5-7].微生物法因其二次污染小、经济环保等优点,已逐渐成为处理含酚废水的主要方法[8].

目前已分离得到多种2,4-DCP降解菌,主要有白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)[9]、芽孢杆菌(Bacillussp.)[10]和假单胞菌(Pseudomonassp.)[11]等.Huang等[12]筛选出黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)降解10 mg/L 2,4-DCP,48 h可完全降解.Wang等[13]利用芽孢杆菌(Bacillusinsoli-tus)处理20 mg/L 2,4-DCP,24 h后2,4-DCP降解率达到77%.张文艺等[14]从农药化工厂土壤中筛选出摩式假单胞菌(Pseudomonasmosselii)HD-1降解30 mg/L 2,4-DCP,10 d降解率达到59.6%.然而这些降解菌对于较低浓度(小于30 mg/L)2,4-DCP的降解效果较好,较高浓度(50 mg/L)2,4-DCP下因微生物生长受抑制导致降解能力下降.近年来也有较高浓度二氯酚降解菌的研究报道.张莹等[15]采用丝瓜瓢作为载体固定白腐菌(Phanerochaetechrysosporium)处理50 mg/L二氯酚废水,12 d降解率可达到86%.Patel等[16]分离出内生芽孢杆菌(Bacillusendophyticus)CP1R降解50 mg/L的2,4-DCP,20 d降解率达到73%.Setlhare等[17]分离出一株假单胞菌(Pseudomonassp.)PKZNSA降解50 mg/L的2,4-DCP,20 d降解率达到64%.文献中较高浓度二氯酚降解菌存在处理时间长、降解效率低等问题,因此筛选高效降解较高浓度2,4-DCP的降解菌具有重要意义.

本研究从活性污泥中分离筛选出一株氯酚高效降解菌株(Corynebacteriumsp.),结合菌株对2,4-DCP耐受性、生理生化特征、生长曲线和在不同碳源下菌株对2,4-DCP的降解特性进行系统分析,为微生物法处理氯酚废水提供了宝贵菌源,为进一步工业化应用提供了技术参考.

1 材料与方法

1.1 培养基LB培养基(g/L):胰蛋白胨 10、酵母提取物 5、NaCl 10;无机盐培养基(g/L):NaCl 0.2、K2HPO40.5、KH2PO40.5、NH4NO31、MgSO4·7H2O 0.2、FeSO4·7H2O 微量;无机盐+葡萄糖混合培养基(g/L):葡萄糖5～10、K2HPO40.25、NH4NO30.5、MgSO4·7H2O 0.1、FeSO4·7H2O 微量;醋酸铅培养基(g/L):胰蛋白胨 10、牛肉浸粉3、NaCl 5、Na2S2O32.5、琼脂12.固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5%(w/v)琼脂.

以上培养基在使用前均经过121 ℃高压蒸汽灭菌30 min,配制1 g/L 2,4-DCP母液,过滤除菌后,按需加入培养基中.

1.2 二氯酚降解菌株的分离筛选实验用活性污泥取自湖北省孝昌县污水处理厂曝气池.从中取10 mL活性污泥转入90 mL LB 液体培养基中,28 ℃、250 r/min 恒温摇床震荡培养24 h.按污泥∶培养基=1∶10的比例转接至含30 mg/L 2,4-DCP的LB培养基中,28 ℃、250 r/min恒温培养48 h.从中取10 mL转接至90 mL含50 mg/L 2,4-DCP的LB培养基,富集培养7 d.将驯化后的菌液稀释涂布到含有2,4-DCP(50 mg/L)的无机盐培养基平板,28 ℃培养 7 d,挑出生长良好的菌落,接种至100 mL含2,4-DCP(50 mg/L)的LB培养基中,在28 ℃、250 r/min的摇床恒温培养24 h,菌液稀释涂布在含2,4-DCP(50 mg/L)的无机盐平板上接种划线,重复3次,分离纯化出耐受2,4-DCP能力最强的菌株,用甘油冷冻保藏于-80 ℃冰箱.

1.3 菌株鉴定

1.3.1 形态学观察 将菌株接种于无机盐固体平板,培养12 h后观察菌落形态.取出菌液离心后加入生理盐水,制成菌悬液,用光学显微镜16×100倍油镜观察细菌形态.

1.3.2 生理生化实验 测定方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[18]《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》[19]进行实验.

1.3.3 菌株16S rDNA的扩增和鉴定 提取菌株DNA扩增16S rDNA序列,16S rDNA扩增引物序列:27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′).PCR扩增体系:总体积为50 μL,PCR Mix 25 μL,27F引物(10 μmol/L)2 μL,1492R引物(10 μmol/L)2 μL,基因组DNA 1 μL,用ddH2O补足.扩增程序:98 ℃预变性2 min,98 ℃变性10 s,57 ℃退火10 s,72 ℃延伸30 s,35个循环,72 ℃最终延伸5 min,4 ℃保存,委托武汉擎科伟业生物科技有限公司检测.测序结果经NCBI的Blast工具与已知核酸序列进行比对,选择同源性较高的已知16S rDNA序列通过MEGA软件构建进化树.

1.4 实验方法

1.4.1 耐受性实验 取1 g/L 的2,4-DCP母液分别稀释至30～170 mg/L.取试管若干,分别加入4 mL LB 培养基和一定浓度的2,4-DCP,液体总体积为 8 mL.向试管中分别接入 50 μL菌液,28 ℃恒温培养24 h,观察试管中的混浊度.当试管中液体澄清时,试管中的2,4-DCP浓度即为最小抑菌浓度(MIC),以此来表征菌株对2,4-DCP的耐受性.

1.4.2 生长及降解实验 活化后的菌株分别接种至含 50 mg/L 2,4-DCP的无机盐培养基、5%葡萄糖+无机盐混合培养基和10%葡萄糖+无机盐混合培养基中,接种量保持一致,使接种后培养基中的初始OD600=0.1,每3 h取样1 mL测定其生物量,绘制生长曲线;每12 h取样1 mL测定2,4-DCP含量,绘制降解曲线,实验均设置3个重复.

1.5 分析方法

1.5.1 菌株生物量的测定 采用UV-1000型紫外-可见分光光度计在600 nm波长下测定菌株的吸光度,OD600值反映菌株在培养基中的生长情况.

1.5.2 2,4-DCP含量的测定 含酚样品经离心后取上清液, 0.22 μm有机相微孔滤膜过滤,采用高效液相色谱法[20]测定2,4-DCP含量.高效液相色谱仪器参数:Agilent 1200 HPLC(Agilent,USA),XDB-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)色谱柱;色谱条件:流动相V(甲醇)∶V(水)=80∶20,检测波长280 nm,流速1 mL/min,柱温 35 ℃,进样量10 μL.

2,4-DCP降解率=(初始浓度-反应后浓度)/初始浓度×100%.

2 结果与讨论

2.1 二氯酚降解菌株的筛选与鉴定经富集培养,分离纯化得到一株以2,4-DCP为唯一碳源生长的菌株,并将其命名为ZH404.

该菌株在无机盐固体平板上培养12 h后,菌落呈圆形,淡黄色,中心隆起,边缘整齐(图1(a)).16×100倍油镜观察,细胞呈现颗粒短棒状(图1(b)).

图1 菌株ZH404菌落及细胞形态

菌株ZH404的生理生化特征如表1所示.该菌为好氧革兰氏阳性菌,具有过氧化氢酶,不能将明胶分解成液状表明不含类蛋白水解酶,未出现使醋酸铅培养基变黑的情况说明在代谢过程中不产生硫化氢,在蛋白胨水培养基中未有玫瑰红色显色反应故不含色氨酸酶,在葡萄糖蛋白胨水培养基中加入甲基红试剂后呈红色表明该菌可以利用葡萄糖.

表1 菌株ZH404生理生化指标

PCR扩增菌株的16S rDNA,并测序.将所测序列在NCBI上进行blast比对,通过比对结果从NCBI中选择出9株同源性较高的菌株序列,在MEGA5软件中进行发育树的构建如图2所示.结果显示该菌株属于棒状菌属,与CorynebacteriumstationisFC25277亲缘关系最相近,鉴定该菌株为停滞棒状杆菌(Corynebacteriumstationis),命名为Corynebacteriumstationissp.ZH404.

2.2 菌株对2,4-DCP的耐受性分析菌株ZH404在含2,4-DCP的 LB 培养基中生长情况如图3和表2所示.当2,4-DCP浓度低于110 mg/L时,对ZH404的生长无明显的抑制作用,菌株生长较好;随着2,4-DCP浓度提高到110 mg/L后,菌株在培养基中的生物量明显减少.在2,4-DCP浓度达到160 mg/L 时,菌株试管振荡培养24 h后菌液澄清,说明此时2,4-DCP的毒性破坏了细胞结构,从而导致菌株无法生长.实验结果表明,菌株ZH404对2,4-DCP的最小抑菌浓度为160 mg/L.

表2 菌株ZH404对2,4-DCP的最小抑菌浓度

图3 菌株在含2,4-DCP的 LB 培养基中生长情况

2.3 外加碳源对菌株生长特性的影响以2,4-DCP(50 mg/L)为底物,分别测定菌株ZH404在添加不同浓度葡萄糖培养基中的生物量.如图4所示,菌株ZH404在含有2,4-DCP的无机盐培养基中的生物量最小,30 h时OD600仅为0.29,说明该菌株能够以2,4-DCP为唯一碳源生长,但菌株生长受到了2,4-DCP的抑制作用.在分别添加5%和10%葡萄糖作为辅助碳源后,30 hOD600分别达到了0.68和0.85,生物量提高了1.3倍和1.9倍,表明添加葡萄糖作为辅助碳源能大幅度提高菌株的生物量.

图4 菌株ZH404的生长曲线

从菌株ZH404在不同培养基中的生长曲线来看,在无机盐培养基中菌株的生长延迟期约为6 h,添加葡萄糖后菌株的生长延迟期不到3 h,说明菌株生长受到了2,4-DCP的抑制作用导致生长延迟期变长,辅助碳源葡萄糖的添加能缓解2,4-DCP对菌株的生长抑制,缩短菌株生长延迟期.添加葡萄糖明显减弱了2,4-DCP对菌株的生长抑制作用,菌株在3 h进入对数生长期,生长明显加快;而在2,4-DCP为唯一碳源条件下,2,4-DCP对菌株的生长抑制并没有随着时间的增加而减弱.

2.4 外加碳源对菌株降解特性的影响实验设置同2.3,分别测定菌株ZH404在不同培养基中的2,4-DCP含量.如图5所示,菌株在无机盐条件下处理10 d,2,4-DCP降解率为40.1%;添加5%葡萄糖后,降解率提高到46.4%;添加10%葡萄糖,降解率大幅提高到63.5%.与2,4-DCP为唯一碳源相比,添加葡萄糖后氯酚降解率分别提高了0.16和0.6倍,与该菌的生长特性表现出一致性.结合菌株生长和降解曲线,在0～24 h内无机盐培养基中生物量增长幅度较小,添加葡萄糖后的培养基中生物量快速增加,而此阶段微生物对2,4-DCP的消耗量较少,说明在对微生物有毒害作用的2,4-DCP与葡萄糖同时存在时,微生物会优先消耗葡萄糖进行快速生长,以抵制2,4-DCP的毒性作用,因而适当增加葡萄糖的投加量能促进生物量的增长.在生长对数期菌株逐渐适应2,4-DCP后,3种培养基中对2,4-DCP的降解效率开始提高,在10%葡萄糖+无机盐混合培养基中这种变化更为明显.进入稳定期后,菌株在无机盐培养基中生物量最少,对2,4-DCP的降解速率最低;10%葡萄糖+无机盐混合培养基中生物量最高,氯酚降解速率最高,说明高生物量能减轻2,4-DCP对菌株的毒性抑制,加快菌株对2,4-DCP的降解速度.

图5 菌株ZH404在不同培养基中对2,4-DCP的降解曲线

本次实验发现,30 h后3种培养基中菌株均保持稳定期生长,在培养6 d之后菌株对2,4-DCP的降解速率减缓,可能进入了衰亡期,10 d后2,4-DCP的浓度几乎不再降低,此时菌株可能已经死亡.说明菌株在进入生长衰亡期后,若不及时补充碳源,菌株无法继续降解2,4-DCP.因此,在生物降解2,4-DCP的过程中,在菌株生长初期和稳定期,添加辅助碳源增强菌株对污染物的耐受能力,减少有毒物质对细胞的毒性和生长抑制,促进菌株生长,高生物量进而提高生物降解2,4-DCP的降解性能[21-22].Liao X等[23]发现在微生物菌群补充葡萄糖可以提高微生物降解效率;Liao H Y等[24]添加0.8%的葡萄糖能提高柠檬酸杆菌对2,4,6-三硝基甲苯的耐受能力和降解效率;Bhattacharya A等[25]在含有葡萄糖的培养基中不动杆菌B9降解188 mg/L苯酚时间缩短了96 h.这些结果表明在添加葡萄糖之后可以帮助减少有毒物质对微生物的毒性和生长抑制,显著提高污染物的降解程度和降解速率.本研究与已报道的结果一致.

3 结论

1)从活性污泥中筛选分离出一株氯酚降解菌株ZH404,经16S rDNA序列分析,鉴定为停滞棒状杆菌(Corynebacteriumstationis),命名为Corynebacteriumstationissp.ZH404.

2)该菌为革兰氏阳性菌,对2,4-DCP的最小抑菌浓度为160 mg/L.

3)添加葡萄糖作为辅助碳源可加快菌株生长,进而提高菌株降解2,4-DCP的能力.添加10%葡萄糖,菌株OD600值在30 h时达到0.85,提高了1.9倍;10 d对2,4-DCP的降解率达到63.5%,提高了0.6倍.