陈海生，陈韬略，蔡林生，李振宇，陈少平，朱友聪，黄霄宇 ，李晨阳

（1.浙江同济科技职业学院，浙江 杭州 311231；2.浙江农林大学 数学与计算机学院，浙江 杭州 311300；3.浙江省余姚第二职业中学，浙江 余姚 315430；4.河南职业技术学院，河南 郑州 450046）

0 引言

河岸缓冲带是介于河流水体与河岸陆域之间的生态过渡区域，兼具水域生态系统和陆地生态系统2种特性［1］，具有丰富的植物多样性和微生物多样性以及独特的生态系统特征和生态服务功能。河岸植被缓冲带能够减缓农业面源污染，其作为河岸带的重要组成部分以及水陆间重要的生态交错带，在控制河岸侵蚀、截留地表径流中的泥沙和养分、保护河溪水质、为水陆动植物提供生境、维护河溪生物多样性和生态系统完整性等方面具有重要作用。刘宏伟等［2］研究了河岸缓冲带不同植被配置方式对重金属的净化效果，结果表明相比于裸土和单一草本植物缓冲带，乔木—草本混合配置缓冲带对重金属离子镉、铜和铅等有较好的净化效果；汤家喜等［3］比较了草木犀带、草木犀与枫杨混合带以及杂草带3种类型人工河岸缓冲带阻控地表径流和悬浮颗粒物的能力，发现草木犀和枫杨混合带对地表径流和悬浮颗粒物的阻控能力最强；赵警卫等［4］比较了草地河岸带和人工林地河岸带对径流污染物TP和TN的截留效果，发现草地河岸带对地表径流TP的截留效果显著优于林地河岸带的，而对氮元素的截留效果差别不明显。但关于河岸缓冲带湿地不同植物根际土壤细菌群落结构和多样性方面的研究报道并不多见。

浙江省有八大水系，即钱塘江、瓯江、椒江、甬江、苕溪、运河、飞云江、鳌江，其中鳌江是水质最差的河流。主要是因为20世纪90年代，鳌江上游的水头、腾蛟两镇制革行业兴起，导致鳌江的水体水质急剧恶化，面临其沿岸植被覆盖率降低、水土流失严重和生物多样性下降等问题。在鳌江流域综合干流治理工程中，河岸缓冲带的生态构建是重点内容，而河岸缓冲带构建的关键是选择合适的缓冲带湿地植被物种。

在湿地生态系统中，微生物在纤维素降解、氮的固定和某些污染物的分解过程中具有重要作用［5］。细菌是土壤微生物中数量最多、分布最广的生物，其功能复杂多样，对环境变化敏感［6］，在维护湿地生物多样性、保持湿地生态平衡方面发挥着重要作用［7］。高通量测序技术可以分析环境微生物总体水平上的种群结构，全面准确地反映环境微生物群落的多样性和群落结构，具有快速、高通量、流程自动化等特点，目前被普遍应用于湿地植物根际土壤微生物群落结构特征的研究［8］。本文以浙江省八大水系中的鳌江为研究区域，比较其河岸缓冲带湿地上自然生长的牛筋草［Eleusine indica (L.)Gaertn］、白茅［Imperata cylindrica (L.) Beauv］和荻草(Miscanthus sacchariflorus)这3种乡土禾本科植物根际土壤的细菌群落结构和多样性，以期为浙江省河岸缓冲带湿地植被生态恢复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

鳌江位于浙江省东南部，是浙江省独流入海的最小水系。全长90 km，流经平阳县13个乡镇。其流域年降水量为1700 mm，年径流量约20亿m3，低潮时平均水深0.8 m，年径流深为1300 mm，年平均含沙量约0.13 kg/m3。多年平均气温为16.8 ℃，属于亚热带海洋性季风气候区。

1.2 样品采集

选取温州市平阳县鳌江流域干流水头段河岸缓冲带上自然分布的3种典型建群种植物，即牛筋草、白茅、荻草，于2022年4月用抖落法采集各植物根际土壤样品［9］。每次共采样15株，3次重复。混合均匀过筛后取10 g土样装入无菌聚乙烯密封口袋中，然后放入干冰盒中邮寄到杭州联川生物技术股份有限公司。

1.3 PCR 扩增及高通量测序

采用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit试剂盒法(D5625，美国Omega公司）提取土样的总DNA。细菌16S rRNA的V4和V5区域扩增引物是338F(5′-ACTCL TACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACT ACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR反应程序为：98℃预试变性30 s；98℃变性10 s、54 ℃退火30 s、72℃延伸45 s，循环3次；然后72 ℃延伸10 min。对PCR扩增产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳检测，合格后由杭州联川公司采用Illumina Miseg高通量测序平台进行测序。使用UPARSE软件以97%为划定阈值对细菌16S rRNA序列划分操作分类单元(OTUs)。

1.4 生物信息学分析流程

根据样品独特的条形码，将配对端序列进行分配，并将建库引入的barcode和引物序列去除，采用FLASH合并匹配端读取。根据 fqtrim(v0.94)软件，在特定的过滤条件下对原始序列读数进行质量过滤，以获得高质量的 clean data。采用Vsearch(v2.3.4)软件对嵌合序列进行过滤。利用DADA2软件进行解调，获得特征表和特征序列。Alpha多样性归一化到相同的随机序列并进行计算。然后根据SILVA(release 132)分类器，利用每个样本的相对丰度对特征丰度进行归一化处理。Alpha多样性用于分析样本物种多样性的复杂性，各样品中的Alpha多样性指标都采用QIIME2软件进行计算，通过对样本Chao1指数和Shannon指数的计算，反映样本内物种的复杂性和多样性［8-9］。采用Blast软件进行序列比对，每个代表性序列用SILVA数据库对特征序列进行注释。使用R(v3.5.2)软件进行制图。

2 结果与分析

2.1 不同植物根际土壤细菌Alpha多样性分析

由表1可知，3种河流缓冲带湿地建群种植物根际土壤细菌有效序列数以荻草根际土壤样品的最多，其次是牛筋草根际土壤样品的，而白茅根际土壤样品的细菌有效序列数最少。各土壤样品的有效序列占比均大于78%，3种植物根际土壤细菌的OTUs数介于7374~8384个，以白茅根际土壤样品的OTUs数最多，为8384个，其次是荻草根际土壤样品的，为7833个，而牛筋草根际土壤细菌的OTUs数最少，为7374个。

表1 河岸缓冲带湿地建群种植物根际土壤细菌有效序列及OTUs数

由表2可知，3种建群种植物根际土壤细菌群落Chao1指数和Shannon指数有明显的差异，其中荻草根际土壤样品的Chao1指数和Shannon指数均为最高，分别为6288.59和11.04，其次是白茅根际土壤样品的，其值分别为6004.55和10.76，而牛筋草根际土壤样品的Chao1指数和Shannon指数均为最低，其值分别为5550.80和10.46。

表2 河岸缓冲带湿地建群种草本植物根际土壤细菌Alpha多样性

2.2 河岸缓冲带湿地建群种植物根际土壤细菌群落结构组成

通过对测序结果的物种注释，从3种植物根际土壤样品中共测得28门、87纲、168目、296科、696属土壤细菌。由图1可知，各植物根际土壤细菌群落组成均以变形菌门(Proteobacteria，45.34%~48.83%)、酸杆菌门(Acidobacteria，20.06%~ 22.69%)为主，其次为相对丰度较高的放线菌门(Actinobacteria，5.30%~7.56%)、厚壁菌门(Firmicutes，2.82%~8.07%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，3.10%~4.19%)、绿弯菌门(Chloroflexia，3.15%~3.60%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes，2.34%~5.06%)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae，0.56%~1.06%)、疣微菌门(Verrucomicrobia，0.40% ~ 0.82%)。

图1 河岸缓冲带湿地建群种植物根际土壤门水平群落结构

图2 河岸缓冲带湿地建群种植物根际土壤纲水平群落结构

河岸缓冲带湿地各建群种植物根际土壤细菌群落结构在门水平上存在差异。土壤变形菌门相对丰度最高的是荻草根际土壤样品，牛筋草根际土壤样品的最低。土壤酸杆菌门相对丰度最高的是牛筋草根际土壤样品，白茅根际土壤样品的最低。土壤放线菌门相对丰度最高的是白茅根际土壤样品，牛筋草根际土壤样品的最低。土壤厚壁菌门相对丰度最高的是牛筋草根际土壤样品，荻草根际土壤样品的最低。土壤拟杆菌门相对丰度最高的是荻草根际土壤样品，荻草根际土壤样品的最低。土壤绿弯菌门相对丰度最高的是牛筋草根际土壤样品，荻草根际土壤样品的最低。土壤硝化螺旋菌门相对丰度最高的是荻草根际土壤样品，白茅根际土壤样品的最低。

从纲水平来看，3种植物根际土壤细菌菌群均以α-变形菌纲(Alphaproteobacteria, 15.25%~18.21%)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria, 13.86%~16.77%)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria, 6.61%-9.78%)为优势菌纲，其他相对丰度较高的菌纲有放线菌纲(Actinobacteria, 5.10%~7.36%)、δ-变形菌纲(Deleaproteobacteria, 5.01%~6.55%)、芽孢杆菌纲(Bacilli，2.18%~4.94%)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes，2.23%~4.94%)。α-变形菌纲的相对丰度以牛筋草根际土壤样品的最高，以荻草根际土壤样品的最低。β-变形菌纲相对丰度以荻草根际土壤样品的最高，以白茅根际土壤样品的最低。γ-变形菌纲相对丰度以牛筋草根际土壤样品的最高，以荻草根际土壤样品的最低。放线菌纲的相对丰度以白茅根际土壤样品的最高，以牛筋草根际土壤样品的最低。δ-变形菌纲相对丰度以白茅根际土壤样品的最高，以牛筋草根际土壤样品的最低。芽孢杆菌纲和芽单胞菌纲的相对丰度均以牛筋草根际土壤样品的最高，以荻草根际土壤样品的最低。

3 结论与讨论

（1） 在湿地生态系统中，微生物种群的多样性对湿地系统生态平衡的维持具有重要作用［10］。湿地土壤微生物群落多样性指数越高，湿地生态系统的水质净化功能也越强［11］。本研究河岸缓冲带湿地3种建群种植物根际土壤细菌群落Chao1指数和Shannon指数有明显的差异，以荻草根际土壤样品的Chao1指数和Shannon指数为最高，说明在鳌江流域河岸缓冲带湿地中禾本科植物荻草对河流水质的提高以及对缓冲带湿地的生态修复和保护均具有重要的作用。

（2） 浙江省鳌江小头段河岸缓冲带湿地3种建群种植物根际土壤细菌群落具有较高的多样性，共测得28门、87纲、168目、296科、696属土壤细菌。在门水平上主要的细菌菌群有变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、疣微菌门、硝化螺旋菌门以及未分类的菌门。在纲水平上主要的细菌菌群有α-变形菌纲、β-变形菌门纲、γ-变形菌纲、放线菌纲、δ-变形菌门纲、芽孢杆菌纲、芽单胞菌纲等。说明该河段河岸缓冲带湿地土壤细菌种类丰富，这对维持河流系统生态平衡具有重要作用。各植物根际土壤细菌在门水平上的菌群以变形菌门和酸杆菌门为主，两者占总测序序列的65.40%~71.52%，这一结果与房昀昊等［8］有关湿地土壤微生物的研究结果相一致。变形菌门具有较强的脱氮除磷作用［12］，本研究以荻草根际土壤样品的相对丰度最高，说明荻草在缓冲带湿地脱氮除磷方面可能发挥着重要作用。酸杆菌门能参与枯枝落叶分解的碳循环［13］，本研究以牛筋草根际土壤样品的相对丰度最高，说明牛筋草根际土壤环境有利于碳的循环转化。绿弯菌门参与了环境中 C、N、S等一系列重要元素的生物地球化学循环过程［14］，本研究中绿弯菌门的相对丰度以牛筋草根际土壤样品的最高，说明该植物在降解河流污染物方面能够发挥重要作用。硝化螺旋菌在好氧条件下能够把亚硝酸盐氧化成硝酸盐，在氮循环中发挥着重要作用，本研究中该菌门相对丰度以荻草根际土壤样品的最高，说明荻草更能促进该区域生态系统的氮循环。