贾中林，尹启生，陈广晴，李许涛，戴华鑫，陈壮壮，梁太波*，张艳玲

（1.深圳烟草工业有限责任公司，广东 深圳 518110；2.中国烟草总公司 郑州烟草研究院，河南 郑州 450001；3.河南省烟草公司，河南 郑州 450000）

成熟度是烟叶质量的核心要素，烟叶适熟采收是生产优质烟叶的关键，对卷烟质量的贡献占整个生产环节的1/3［1-2］。烤烟上部烟叶是指烟株顶部4~6片烟叶，占单株总产量的40%左右；相比其他部位的烟叶，上部烟叶烟气浓度更高、香气量更足、满足感更强，优质的上部烟叶是生产高档卷烟的重要原料，对卷烟香味及风格都有很大贡献［3］。良好的成熟度是保证烤烟烘烤质量的前提，受生态环境、品种特性及栽培技术等多种因素影响，不同地区适宜的上部烟叶采收成熟度存在明显差异。刘辉等［4］研究认为，贵阳烟区云烟87上部烟叶在叶面80%黄绿色、主脉变白2/3以上时采收，烤后烟叶的外观和感官质量较好；王春凯等［5］研究认为，云烟97在7~8成黄时采收的烤后烟叶感官评吸质量显著优于8~9成黄时采收的烤后烟叶；张冰濯等［6］研究表明，湘南烟区烤烟上部烟叶适当提高采收成熟度，可以改善烟叶的外观和感官品质，但当成熟度超过一定程度后，烟叶质量呈现出下降趋势，具体表现为烟叶过熟、身份变薄、油分减少、香气质下降、杂气和刺激性增加。目前，河南部分烟区仍存在上部烟叶采生、采青现象，导致烤后烟叶存在组织结构紧密，化学成分不协调，刺激性大、杂气重等问题。此外，由于受烟株个体差异和环境因素的影响，即使在同一采收期，不同上部烟叶的成熟度和鲜烟素质也会存在较大差异。因此，针对产区实际情况，明确采收成熟度对烤烟上部烟叶质量的影响，对确定适宜采收成熟度、提高上部烟叶质量具有重要意义。本试验以豫西地区主栽品种云烟99为研究对象，参照当地烟农采收上部烟叶实际状况，在大田烟叶成熟期采集不同成熟度的上部烟叶，通过分析不同成熟度鲜烟叶生理生化指标和初烤烟叶内外在质量情况，明确成熟度对鲜烟叶生理特性及烤后烟叶质量的影响，为高可用性上部烟叶的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021年在河南省三门峡灵宝市朱阳镇进行。供试烤烟品种为当地主栽品种云烟99。试验地土壤为褐土，土壤理化性质为：pH值7.8，有机质含量12.4 g/kg，碱解氮含量54.2 mg/kg，有效磷含量25.2 mg/kg，速效钾含量233 mg/kg。大田移栽行距为1.20 m，株距为0.50 m，其他田间管理措施按照当地优质烤烟生产技术规程实施。

1.2 试验设计

在烤烟上部烟叶成熟期，依据叶面颜色和主脉变白程度，对上部倒数第3~4片烟叶进行成熟度档次划分，分为4个成熟度梯度：M1，叶面60%~70%黄绿色、主脉变白1/4左右；M2，叶面70%~80%黄绿色、主脉变白1/2左右；M3，叶面80%~90%黄绿色、主脉变白3/4左右；M4，叶面90%~100%黄绿色、主脉基本全白。每个梯度采集200片左右烟叶，一部分带回实验室测定生理指标，另一部分按照当地常规烘烤工艺烘烤，采集烤后烟叶样品，测定化学成分并进行感官质量评价。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 烟叶生理指标测定 质体色素测定：质体色素含量测定采用李合生［7］的方法，用80%丙酮作为提取液，分别在波长663、646和470 nm下测定其吸光值，根据公式计算相应的色素含量，分光光度计为岛津UV-2550型。

生物酶活性测定：采用苏州格锐思生物科技有限公司的酶活试剂盒，分别对鲜烟叶碳代谢相关的淀粉酶、蔗糖转化酶和氮代谢相关的硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶进行测定。

1.3.2 烟叶化学成分测定 依据文献［8］对鲜烟叶冷冻干燥后的化学成分进行检测，初烤烟叶先在55 ℃下鼓风干燥，粉碎过60目筛后再进行化学成分检测。按照标准YC/T 216—2007［9］测定烟叶淀粉含量，按照标准YC/T 159—2002［10］测定水溶性糖含量，按照标准YC/T 160—2002［11］测定总植物碱含量，按照标准YC/T 161—2002［12］测定总氮含量，按照标准YC/T 282—2009［13］测定游离氨基酸含量，按照标准YC/T 447—2012［14］测定糖组分（葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖）含量。

1.3.3 中性致香成分测定 采用GC/MS测定烤后烟叶中性致香成分，采用同时蒸馏萃取法进行前处理，以二氯甲烷为萃取溶剂，同时蒸馏萃取时间为2 h。萃取完后，将二氯甲烷萃取液用无水硫酸钠干燥，然后在50 ℃下旋转蒸发浓缩至1 mL，加入内标（乙酸苯乙酯），进行GC/MS分析。分析所得图谱经NIST计算机谱库检索，选择化合物的特征离子为定量离子，以其定量离子面积和内标定量离子面积比计算其相对含量。

GC/MS条件：色谱柱为DB-5弹性石英毛细管柱（60.00 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：270 ℃；分流比：20∶1；进样量：1 μL ；载气：氦气；载气流量：1 mL/min；传输线温度：280 ℃；离子源温度：230℃；电离方式：EI；电离电压：70 eV；质量数范围：30~350。

1.3.4 感官质量评价 每个成熟度梯度选取调制后具有代表性的烟叶2.0 kg，对烤后烟叶进行抽梗、切丝、卷接，按照YC/T 138—1998［15］烟草及烟草制品感官评价方法的规定进行感官品质鉴定，评价指标包括香气质、香气量、杂气、刺激性、余味等，感官质量评价总分根据赋值法计算。

1.3.5 数据处理 采用 Microsoft Excel 2019、SPSS 24.0软件进行数据整理和统计分析，利用单因素法方差分析和 Duncan’s 新复极差法比较检验显著性差异。

2 结果与分析

2.1 成熟度对烟叶质体色素含量的影响

随着成熟度的增加，烟叶中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量及类胡萝卜素含量的变化规律相似，均呈逐渐降低的趋势（图1）。烟叶中叶绿素和类胡萝卜素含量均以M1成熟度最高，M4最低，不同成熟度之间存在较大差异。整个成熟过程中叶绿a降解量为0.54 mg/g，大于叶绿素b的降解量（0.15 mg/g)，叶绿素的总降解量为0.69 mg/g，类胡萝卜素的降解量为0.12 mg/g。叶绿素的降解量明显高于类胡萝卜素的，这也是在烟叶成熟过程中颜色由绿转黄的重要原因。

图1 不同成熟度烟叶质体色素含量

2.2 成熟度对烟叶碳氮代谢酶活性的影响

不同成熟度烟叶碳氮代谢相关酶活性变化如图2所示，随着成熟度的增加，鲜烟叶淀粉酶活性逐渐降低，在M1成熟度时为8.05 mg/(min·g)，至M4时降至4.05 mg/(min·g)；蔗糖转化酶活性呈先降低后升高的变化趋势，在M4成熟度时达到最大值，为1.30 μg/(min·g)，说明在烟叶成熟过程中淀粉的分解代谢逐渐减弱，而蔗糖的分解代谢逐渐增强。烟叶氮代谢关键酶硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性随着成熟度的增加呈抛物线变化，在M2成熟度时达到最大值，分别为86.33 μg/(h·g)和9.53 U/g，之后活性迅速下降，说明在烟叶成熟后期氮合成代谢强度逐渐降低。

图2 不同成熟度烟叶碳氮代谢相关酶活性

2.3 成熟度对烟叶碳氮代谢产物的影响

从图3A可以看出，随着成熟度的增加，鲜烟叶碳代谢产物中总糖、还原糖和淀粉含量均表现出先升高后降低的变化趋势，还原糖含量的最大值出现在M2成熟度时，为7.48%；总糖和淀粉含量在M3成熟度时达到最大值，分别为12.05%和36.80%。对碳代谢产物中可溶性糖组分进行分析（图3B），发现果糖和葡萄糖在糖组分中所占比重较大，含量在25~40 mg/g之间，蔗糖和麦芽糖含量相对较低，在3~10 mg/g之间。随着成熟度的增加，果糖和葡萄糖含量呈先升高后降低的变化趋势，蔗糖含量逐渐升高，麦芽糖含量则逐渐降低。随着成熟度的增加，鲜烟叶氮代谢产物中总氮和游离氨基酸含量逐渐降低（图4），在M4成熟度时降至最小值，分别为1.96%和4.65 μg/g，较M1成熟度分别下降了17.30%和50.27%。烟叶总植物碱含量呈先升高后降低的变化趋势，在M2成熟度时达到最大值，为3.41%，之后逐渐降低。

图3 不同成熟度鲜烟叶碳代谢产物含量

图4 不同成熟度鲜烟叶氮代谢产物含量

2.4 成熟度对烤后烟叶化学成分的影响

由表1可以看出，随着成熟度的增加，烤后烟叶的总糖、还原糖含量呈先升高后降低的变化趋势，均在M3成熟度时达到最大值，分别为26.94%和22.51%；总氮含量整体呈逐渐降低的变化趋势；总植物碱和淀粉含量呈逐渐增加的变化趋势，至M4成熟度时达到最大值，分别为3.66%和5.02%。烤后烟叶的氮碱比值随着成熟度的增加而逐渐降低，糖碱比值则表现为先增加后降低的变化趋势。

表1 不同成熟度烤后烟叶化学成分 %

不同成熟度烤后烟叶游离氨基酸含量如表2所示，本研究共检测了21种游离氨基酸，包括18种蛋白氨基酸和3种非蛋白氨基酸。参照文献［16］将蛋白氨基酸分为八大类，分别为酸性、碱性、芳香族、脂肪族、含羟基类、含硫类、亚氨基酸类和酰胺类氨基酸。与鲜烟叶相比，烤后烟叶中游离氨基酸含量显著增加。随着成熟度的增加，烤后烟叶各氨基酸组分与总游离氨基酸含量变化趋势相似，均呈逐渐降低的趋势。整个成熟过程中游离氨基酸总量下降了17.15 mg/g，以亚氨基酸类含量下降最多，为9.78 mg/g。烟叶中芳香族、酸性、碱性和酰胺类氨基酸占总游离氨基酸的比例随着成熟度的增加呈逐渐降低的趋势，而脂肪族和亚氨基酸含量占比整体呈升高的趋势。

表2 不同成熟度烤后烟叶游离氨基酸含量 mg/g

对烤后烟叶可溶性糖组分含量（图5）进行分析发现，与鲜烟叶相比，烤后烟叶的果糖和葡萄糖含量均显著增加，而蔗糖和麦芽糖含量出现了不同程度的下降，这与烘烤过程中蔗糖的进一步降解密切相关。烤后烟叶的糖组分占比仍以果糖和葡萄糖含量占比较高，但两者含量差异较鲜烟叶变小。随着成熟度的增加，烤后烟叶中果糖和葡萄糖含量呈先升高后降低的趋势，最大值均出现在M3成熟度时，分别为132.17、132.41 mg/g。蔗糖和麦芽糖含量相对较低，随着成熟度的提升，蔗糖含量略微下降，麦芽糖含量有升高的趋势。

图5 不同成熟度烤后烟叶糖组分含量

2.5 成熟度对烤后烟叶中性致香物质含量的影响

经GC/MS分析检测得到了61种中性致香成分，按照致香官能团的不同，可以将所测致香物质划分为醛类（13种）、醇类（7种）、酮类（32种）、酚类（1种）、酯类（5种）和含氮杂环类化合物（3种）。不同成熟度烟叶中以酮类物质含量占比最大，醇类物质占比次之。随着烟叶成熟度的增加，酮类和中性致香物质总含量均呈先升高后降低的变化趋势（图6），其中在M3成熟度时含量最高，分别为71.61和88.27 μg/g，醇类物质的含量逐渐增加，最大值出现在M4成熟度时，为21.17 μg/g。醛类物质含量在成熟过程中呈逐渐降低的变化趋势，在M4成熟度时降至最低，为1.92 μg/g。酚类、酯类等其他类致香物质在烤后烟叶中含量较低，且随着成熟度的增加整体呈升高的趋势。

图6 不同成熟度烤后烟叶中性致香物质含量

2.6 成熟度对烤后烟叶感官质量的影响

随着成熟度的增加，烤后烟叶感官质量总分呈先升高后略微降低的变化趋势，以M3成熟度的分数最高（表3）。各项指标得分随着成熟度的提升，整体上表现出升高的趋势，但也有个别指标如香气量、劲头、刺激性和余味的评价分数在M4时略有降低。综合分析表明，在M3成熟度时烤后烟叶香气质好、香气量足、劲头适中、刺激性小、余味更舒适，感官质量评价最好。

表3 不同成熟度烤后烟叶感官质量评价 分

3 讨论

烟叶质体色素是重要的香气前体物质，其本身不具有特征香气，但可以通过分解、转化形成对烟叶品质有重要贡献的香气成分［17］。在烟叶成熟过程中，随着成熟度的不断提升，叶绿体结构由完整到破裂，叶绿素发生降解［18］。本试验结果显示，随着烟叶成熟度的提高，叶绿素和类胡萝卜素含量均逐渐降低，与前人研究结果类似［19-21］。叶绿素含量作为植物生长过程的一个重要生化参数，常被用来指示叶片的生理状况［22］。在整个成熟过程中叶绿素降解量显著大于类胡萝卜素降解量，叶绿素和类胡萝卜素含量的变化差异是造成不同成熟度烟叶之间颜色差异的主要原因，这一颜色变化也是目前生产上判断烟叶成熟度的主要依据［23］。

烟叶成熟过程中，碳氮代谢的强度、协调程度以及动态变化会直接影响烟叶中各类化学成分的含量和比例［24］。淀粉酶是碳水化合物积累代谢过程中的关键酶，负责将烟叶中的淀粉降解为糖类。随着烟叶成熟度的提高，淀粉酶活性逐渐降低，说明淀粉的降解能力在下降，这与鲜烟叶中淀粉含量的积累变化相反［25］。蔗糖转化酶可以催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖，其活性大小反映了烟叶对光合产物的利用程度。随着成熟度的增加，蔗糖转化酶活性整体呈升高趋势，与鲜烟叶中糖含量的变化趋势相同。本研究还发现，淀粉和糖类物质的含量在M4成熟度时均出现了不同程度的下降，可能与烟叶衰老程度加深，大部分干物质随着呼吸消耗的降解有关［26］。一般认为，烟叶氮代谢强度在叶片功能盛期时较强，之后随着成熟度的提高氮代谢强度逐渐减弱，碳代谢强度逐渐增强［24］。硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶是植物体内参与氮素还原、同化和循环的关键酶。贾保顺等［27］研究表明，在烟叶移栽后80~110 d硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性整体呈下降趋势。本试验发现，在烟叶成熟前期（M1~M2）氮代谢相关酶活性短暂升高，在成熟后期（M2~M4）酶活性迅速降低，与前人研究结果类似［28］。烟叶成熟过程中总植物碱含量与氮代谢相关酶活性的变化趋势相同，总氮和游离氨基酸含量均呈逐渐降低的变化趋势，这与衰老叶片中氮素转移活动以及氨挥发有关［29-30］。总体来看，在烟叶成熟后期，烟叶氮代谢活动强度逐渐减弱，碳的积累代谢活动逐渐增强。

烤后烟叶化学成分与感官质量密切相关，影响上部烟叶感官质量最主要的化学成分是总氮、总糖和烟碱［31］。目前，我国多数产区上部烟叶总氮和烟碱含量高于国外优质上部烟叶。随着烟叶成熟度的增加，烤后烟叶总氮含量呈下降趋势，总糖含量呈升高趋势，说明在一定程度上提高烟叶成熟度，有利于协调烤后烟叶化学成分，提高烟叶质量［32］。本研究发现，烤后烟叶淀粉含量在M4成熟度时最高，与赵高坤等［33］的研究结果相似，相关原因可能与过熟烟叶淀粉酶活性较低，在烘烤过程中对淀粉的降解不彻底有关。氨基酸在调制过程中发生的美拉德反应是烟草中重要的致香反应，烟叶游离氨基酸含量与感官品质密切相关［16］。本试验结果显示，成熟度高的烟叶中游离氨基酸含量较低，氨基酸组分中脯氨酸含量占比较高，而与品质呈负相关的芳香族、酸性和碱性氨基酸含量占比较低，可能与成熟度高的烟叶在烘烤过程中更有利于氨基酸的降解转化有关［34］。氨基酸与还原糖发生的棕色化反应是烤后烟叶中性致香成分中酮类物质的主要来源，随着成熟度的提高，中性致香物质含量呈先升高后降低的变化趋势，与烤后烟叶感官质量变化一致，说明在一定范围内提高烟叶成熟度有利于烤后烟叶质量的提升［35］。

4 结论

随着成熟度的增加，烟叶氮代谢活动强度逐渐减弱，总氮和游离氨基酸含量均逐渐降低，总植物碱含量呈增加趋势。随着成熟度的提高，烟叶中淀粉的分解代谢活动逐渐减弱，蔗糖的分解代谢逐渐增强，烟叶中糖含量随着成熟度的增加达到最大值后开始下降。采收成熟度对烤后烟叶质量有较大影响，豫西地区上部烟叶以M3成熟度采收时，烤后烟叶内在化学成分较协调，中性致香物质含量高，感官质量最佳。